米曲霉HDF-7產蛋白酶水解大豆蛋白及其制醬的初步研究

丁 昊，于艷穎，凌宏志，宋 剛，平文祥，葛菁萍*

（1.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

豆醬是一類傳統發酵食品[1]，以大豆為主要原料，經煮制、壓塊、制曲發酵制成。其中含有多種人體所需營養成分[2]，經微生物發酵后使其容易被人體消化，并可改善人體腸道功能[3]。許多微生物在豆醬發酵過程中起著重要作用，包括芽孢桿菌、乳桿菌、霉菌、酵母菌等[4-5]，其中米曲霉（Aspergillus oryzae）是發酵過程中的主要微生物[6]。

王哲等[7]研究發現，傳統豆醬制作工藝制曲時間長且受季節限制，通常需要2～4個月，后續為達到最佳風味還需充分發酵3個月。雖然有文獻報道[8-9]，利用傳統方法制醬，控制發酵條件，使得醬發酵至成品的時間大大縮短，由180d縮短至50 d，但還是較酶法制醬時間長。何立濤等[10]研究發現，利用酶法制醬去除制曲步驟，可以使豆醬出品率提高20%。目前，用于制醬的商品酶制劑大多來源于青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、枯草桿菌（Bacillussubtilis）。CASTRO R J S D等[11]通過使用分離的米曲霉LBA01產生的蛋白酶對大豆分離蛋白進行催化，結果顯示，該蛋白酶具有很好的催化活性；曾小波[12]通過研究兩株米曲霉蛋白酶在酸性條件下對大豆蛋白的水解能力，結果顯示，兩株米曲霉所產的蛋白酶均具有較強的水解能力，且均隨著pH值的升高，水解程度提高。目前，關于應用米曲霉蛋白酶制醬的研究還未見報道。

本研究以傳統豆醬中篩選得到的米曲霉HDF-7為出發菌株，通過鹽析、凝膠過濾對其所產的蛋白酶進行分離純化，利用純化后的蛋白酶對大豆蛋白進行水解，分析蛋白質的降解情況及氨基酸含量的變化，并將其應用于豆醬的制作，為其在工業制醬的研究發展提供依據，同時促進酶制劑市場的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

米曲霉HDF-7：黑龍江大學微生物重點實驗室，分離自豆醬；大豆蛋白粉：淘寶商城；氫氧化鈉（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；鹽酸（分析純）：沈陽市派爾精細化工制品廠；氨水（分析純）：北京化工廠。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

查氏瓊脂培養基：蔗糖30 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硝酸鈉2 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，瓊脂20 g/L，氯化鉀0.5 g/L。

發酵培養基：酵母提取物3 g/L，葡萄糖10 g/L，麥芽浸膏3 g/L，大豆蛋白胨5 g/L。

以上培養基pH值均自然，用蒸餾水配制，121℃高溫濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Air TECH超凈工作臺：蘇凈集團安泰有限公司；HQL300A柜式恒溫冷凍搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；BG-verMINI迷你垂直電泳儀：北京百晶生物技術有限公司；L-8800氨基酸自動分析儀：日本HiTACHI公司；凝膠層析介質Sephedex G-50：瑞典Amersham公司；732濕強酸性陽離子交換樹脂：美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

將米曲霉HDF-7斜面于28℃培養箱中培養5 d，加入10 mL無菌生理鹽水，洗脫孢子。孢子懸液經無菌擦鏡紙過濾于無菌三角瓶（含玻璃珠）中，28℃、300 r/min條件下振蕩0.5 h，孢子濃度調至107個/mL。

按1%的接種量將孢子懸液接種于發酵培養基中，28℃、180 r/min條件下培養2 d，離心，上清液即為粗酶液，采用福林-酚試劑測定其蛋白酶活力[13]，重復測定3次。

1.3.2 蛋白酶的分離純化

采用不同飽和度的硫酸銨（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）對粗酶液進行鹽析，確定最適硫酸銨飽和度；采用葡聚糖凝膠G-50層析法對硫酸銨鹽析沉淀進行分離、純化；采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對純化的米曲霉HDF-7蛋白酶進行檢測；回收純化后的單一蛋白條帶，送至上海基康公司進行N端氨基酸測序，測序結果在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進行比對，具體步驟參照文獻[14]。

1.3.3 蛋白酶水解大豆蛋白的研究

將2 g大豆蛋白粉加入10 mL去離子水中，50℃條件下水浴溶解10 min，然后加入5 mL蛋白酶酶液（40 U/mL），迅速混勻，反應2 h。待反應結束后，煮沸10 min，使蛋白酶完全變性失活。煮沸后樣品靜置、冷卻，10 000 r/min條件下常溫離心20 min，棄沉淀，取上清液待測，以不加酶液的樣品作為空白對照。

大豆蛋白質降解分析：利用SDS-PAGE對酶解前后大豆蛋白成分的分子質量大小的分布進行比較。具體步驟參照文獻[15]。

氨基酸含量的變化：參照文獻[16]對732濕強酸性陽離子交換樹脂進行前處理。取5 g處理后的樹脂于燒杯中，加入20 mL大豆蛋白水解液，37℃水浴振蕩1 h，棄樣液。去離子水清洗樹脂2～3次，樹脂中加入15 mL氨水（5 mol/L），37℃水浴振蕩10 min，取清液。氨水洗脫一次，融合兩次洗液并采用沸水浴蒸干。用0.02 mol/L HCl定容至50 mL，混勻，獲得樣品。以原鹽酸溶液為空白對照組，利用氨基酸自動分析儀進行檢測。

1.3.4 酶法制醬初步研究

原料預處理：100 g大豆蛋白粉中加入15%的鹽水100 mL，充分攪勻后于121℃條件下高壓滅菌15 min。

豆醬的發酵：原料冷卻至40～45℃后，按照15 U/g原料加入純化的蛋白酶，充分攪拌均勻，保溫發酵。發酵3 d后升溫至50℃，繼續保溫發酵4 d，期間每天攪拌一次。

1.3.5 豆醬的感官評價

以曲法制得的豆醬（寶泉牌）作對照，邀請數位試吃人員對豆醬的色、香、味及發酵形態進行整體性評價[17]。

1.3.6 豆醬理化指標的測定

總酸的測定：參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》；食鹽的測定：參照GB5009.42—2016《食品安全國家標準食鹽指標的測定》；鉛的檢測：參照GB5009.12—2010《食品安全國家標準食品中鉛的測定》；總砷的測定：參照GB 5009.11—2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》；總氨基酸態氮的測定：參照GB/T5009.40—2003《醬衛生標準的分析方法》；總黃曲霉毒素B1的測定：參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》。

1.3.7 豆醬微生物指標的測定

大腸菌群的測定：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》；致病菌的測定：參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、GB4789.10—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.5—2012《食品安全國家標準食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗》。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶純化結果

2.1.1 （NH4）2SO4鹽析飽和度的確定

（NH4）2SO4沉淀蛋白酶的鹽析曲線見圖1。

圖1 蛋白酶硫酸銨鹽析曲線Fig.1 Salting-out curve of ammonium sulfate of protease

由圖1可知，隨著硫酸銨溶液飽和度逐漸上升，上清液中剩余酶活也逐漸降低，當飽和度達到70%時，剩余酶活最低，為（3.34±0.24）U/mL，相對酶活為（13.53±0.96）%；當飽和度達到80%時，剩余酶活為（3.39±0.25）U/mL，相對酶活為（13.73±1.01）%，變化不明顯，因此，硫酸銨沉淀蛋白酶的最佳飽和度是70%。

2.1.2 Sephadex G-50層析

利用Sephadex G-50對鹽析沉淀進行層析，結果見圖2。

圖2 蛋白酶Sephadex G-50層析柱洗脫曲線Fig.2 Elution profile of protease on Sephadex G-50 column

由圖2可知，鹽析沉淀經Sephadex G-50層析后得到洗脫峰1和2，根據層析原理可知，洗脫峰1的分子質量大于洗脫峰2，對兩峰的收集液的蛋白酶活進行測定發現，酶活主要集中在洗脫峰1中，留存洗脫峰1的收集液以備后續檢測。

2.1.3 SDS-PAGE結果

將純化后的蛋白酶進行SDS-PAGE，經染色脫色后得到圖3。

圖3 純化后蛋白酶的SDS-PAGE結果Fig.3 SDS-PAGE result of protease after purification

由圖3可知，洗脫峰1經SDS-PAGE檢測后，為單一條帶，說明此蛋白酶已達到電泳純。根據蛋白質Marker可推測，此蛋白酶分子質量為30 kDa左右。

2.1.4 氨基酸序列分析

切下目標條帶（30kDa）送至上海基康公司進行N端氨基酸測序，得到含12個氨基酸的序列：GGGNDYVILNAQ。將此氨基酸序列在NCBI上比對后發現，其與米曲霉（Aspergillus oryzae）RIB40的中性蛋白酶（ACCESSION：AAT68480）的N端序列具有很高的相似度。

2.2 蛋白酶水解大豆蛋白的研究

2.2.1 大豆蛋白質降解產物的分析

大豆蛋白主要是球蛋白，根據不同分子質量可分為2S、7S、11S和15S四組[18]，其中以7S和11S為主。主要成分有胰蛋白酶抑制劑、細胞色素C、大豆凝集素、解脂酶、β-淀粉酶、7S球蛋白、11S球蛋白[19]。大豆蛋白經水解后，產物以糖基化氨基酸和氨基酸為主。劉汝萃等[20]利用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白發現，酶解主要發生在7S和11S的酸性亞基上，但隨著酶解時間的延長，7S亞基條帶變化并不顯著。

利用純化的米曲霉蛋白酶HDF-7對大豆蛋白進行水解，采用SDS-PAGE對水解產物進行分析，結果見圖4。

圖4 酶解前后大豆蛋白的SDS-PAGE結果Fig.4 SDS-PAGE results of soybean protein before and after enzymatic hydrolysis

由圖4可知，根據蛋白分子質量推測大豆蛋白經米曲霉HDF-7蛋白酶酶解后，其中大豆凝集素、解脂酶及一些球蛋白被水解，而胰蛋白酶抑制劑和β-淀粉酶無明顯變化，且一些小分子蛋白也未被水解。

大豆凝集素是一種糖蛋白，是一種抗營養因子，具有凝集和促分裂的生物學活性，可由小腸上皮進入循環系統進而誘發免疫反應，破壞機體正常代謝，導致小腸粘膜損傷，內源氮的大量損失，體蛋白加強分解等一系列反應[21]。本實驗提取的米曲霉HDF-7蛋白酶能有效水解大豆凝集素，阻止其抗營養作用，使大豆蛋白營養成分更易被吸收，并大大減少對機體的不良影響。

2.2.2 氨基酸含量的變化

由于氨基酸是一種多官能團分子，食用后可與風味受體結合產生特定風味。因此，豆醬中的游離氨基酸的種類和數量對其品質顯得尤為重要[22-23]。利用732濕強酸性陽離子交換樹脂提取大豆蛋白的水解產物，用氨基酸自動分析儀測定水解產物中各種氨基酸的含量，大豆蛋白酶解前后氨基酸種類的譜圖分別見圖5和圖6。酶解前后各種氨基酸含量的變化結果見表1。

圖5 大豆蛋白酶解前氨基酸分析色譜圖Fig.5 Chromatogram of amino acid analysis before enzymatic hydrolysis of soybean protein

圖6 大豆蛋白酶解后氨基酸分析色譜圖Fig.6 Chromatogram of amino acid analysis after enzymatichydrolysis of soybean protein

由表1可知，大豆蛋白經米曲霉HDF-7蛋白酶酶解后，總氨基酸含量較酶解前增加18.2%，其中半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸含量明顯提高（P＜0.01）。立體構型不同的氨基酸含有不同的味道[24]，丙氨酸含有很強的甜味，而精氨酸有苦味，纈氨酸有微甜但略苦的味道，因此，米曲霉HDF-7蛋白酶是一種有潛在應用價值的生物催化劑。

表1 大豆蛋白酶解前后氨基酸含量的變化Table1 Changes of amino acid contents of before and after enzymatic hydrolysis of soybean protein

2.3 豆醬的感官評價

傳統豆醬色澤大體呈深紅或深棕褐色、醬體光亮細膩，醬香濃香綿柔，無不良刺激氣味，鮮味突出、咸甜適宜，粘稠適度、均勻、無雜質。但是傳統豆醬制作耗時費工（20 d），因此，嘗試直接將純化的蛋白酶加入大豆豆粉中制醬，對其進行感官評價，結果見表2。

表2 豆醬的感官品評結果Table 2 Results of sensory evaluation of soybean sauce

由表2可知，與傳統的曲法制得的豆醬相比，酶法制得的豆醬呈醬褐色，口感適宜，咸而不膩，具有醬、酯香，且醬整體偏稀，鮮味也比較適中。總體來說，其風味、外觀與傳統豆醬差別不大，但傳統曲法制醬耗時長，酶法制醬時間短（7 d），工藝較簡單。

2.4 豆醬理化指標的測定

豆醬中總酸含量為1.78g/100g，符合國標中總酸含量≤2.0 g/100 g的要求；食鹽含量為45 g/100 g，符合國標中食鹽含量≥12.0 g/100 g的要求；鉛含量為0.02 mg/kg，符合國標中鉛含量≤0.5 mg/kg的要求；總砷含量為0.1 mg/kg，符合國標中總砷含量≤0.5 mg/kg的要求；總氨基酸態氮含量為0.97g/100g，符合國標中氨基酸態氮含量≥0.3 g/100 g的要求；黃曲霉毒素B1含量＜5 μg/kg，符合國標中黃曲霉毒素B1含量≤5 μg/kg的要求。

2.5 豆醬微生物指標的測定

豆醬中大腸菌群呈陰性，符合國標中大腸菌群量≤30 MPN/100 g的要求；未檢出沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等致病菌，符合豆醬中致病菌不得檢出的要求。

3 結論

采用鹽析法、凝膠過濾法分離純化得到米曲霉HDF-7蛋白酶，該蛋白酶對大豆蛋白水解后，大豆凝集素、解脂酶及一些球蛋白被水解，且總氨基酸含量較水解前增加18.2%，其中丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量明顯提高。采用該蛋白酶制作的豆醬除粘著性不高，呈現稀態外，其風味、外觀與傳統豆醬差別不大，理化指標和微生物指標均符合相關國標要求，且大大縮短了制醬時間（7d），為其在工業制醬的研究發展中提供依據，同時對酶制劑市場的發展具有促進作用。