醬香型白酒高溫大曲游離氨基酸比較分析

張巧玲，呂錫斌，秦 興，陳良強，楊 帆，王和玉，王 莉*

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

以小麥為原料制成的醬香型高溫大曲含有多種菌種及酶類[1-2]，在醬香型白酒生產過程中起著菌種劑、糖化、發酵、生香以及提供營養底物的功能，大曲的質量直接關系著酒的風格和質量[3-6]。在制曲的過程中，由于發酵倉內溫度、水分等參數指標的差異，使得大曲拆倉時易形成三種類別的大曲，即白曲、黃曲和黑曲[7-9]。在實際生產中，白曲、黃曲和黑曲經過存儲后混合磨碎投入制酒生產使用，因此大曲質量的評判對制酒生產有重要影響[10]。

在制曲過程中，大曲中的游離氨基酸和碳水化合物作用產生美拉德反應，使大曲顏色加深，美拉德反應是大曲色澤形成的重要原因[11]，從而影響大曲質量的感官判別。同時，游離氨基酸是微生物生長代謝賴以生存的氮源來源之一，影響著微生物的生長情況和代謝物的產生[12]。氨基酸還可作為高級醇、酯類等大曲香氣物質形成的重要前體物質[13-14]，不同的氨基酸能呈現甜、鮮、苦等味道，對白酒的風味及口感形成起著重要作用。

吳光斌等[15]對不同等級中溫大曲的氨基酸含量進行了研究，并發現游離氨基酸與大曲質量有一定的關系。龔士選等[16]曾提出用α-氨基酸態氮含量評價大曲質量。炊偉強[17]通過分析濃香型高溫大曲和中高溫大曲的游離氨基酸，發現優質大曲中游離氨基酸總量均高于普級大曲，高溫優質大曲中鮮味氨基酸顯著高于普級大曲。該研究結合感官評價分類結果，采用茚三酮衍生法對醬香型白酒高溫大曲拆倉大曲進行游離氨基酸分析，以探討大曲游離氨基酸與大曲質量的關系，為進一步揭示不同類別大曲的功能奠定基礎，同時為醬香型大曲制曲標準化發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒高溫大曲：經感官評價分類的高溫拆倉大曲，其中白曲16個，黃曲19個，黑曲21個，均取自貴州茅臺酒股份有限公司。

酸性和中性氨基酸及相關化合物標準品（β-丙氨酸、L-丙氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、α-氨基異丁酸、天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、磷酸絲氨酸、脯氨酸、磷酸乙醇胺、蘇氨酸、?；撬?、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸）、生理和堿性氨基酸及相關化合物標準品（γ-氨基丁酸、鵝肌肽、精氨酸、肌肽、乙醇胺、組氨酸、同半胱胺酸、羥賴氨酸、賴氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、鳥氨酸、色氨酸）：美國Sigma Aldrich公司；磺基水楊酸（分析純）：中國BBI生命科學公司；Ultra Physiological Fluid Chenical Kit：英國Biochrmo公司。

1.2 儀器與設備

Biochrom30+氨基酸分析儀：英國Biochrom公司；MIKRO 220R臺式高速冷凍離心機：德國Hettich公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取1g大曲加入至10mL純凈水中，劇烈振蕩混勻10min，4℃放置過夜，浸出其可溶性成分，10000r/min離心15min。取濾液5 mL于離心管中，加入5 mL 10%的磺基水楊酸，振蕩混勻后12000r/min離心15min，取上清液1mL，用0.45μm微孔濾膜過濾后，上機檢測。

1.3.2 測定方法

測定條件：Peeku-1884離子分離柱，鋰型Ultropac8陽離子交換樹脂，梯度洗脫，分離柱柱溫31～67℃，反應單元溫度135℃；泵Ⅰ（緩沖液）流速35mL/h，泵壓力1.5～14.5MPa，泵Ⅱ（反應液）流速25 mL/h，泵壓力0.2～1.2 MPa；檢測波長：一通道570 nm，二通道440 nm。

1.3.3 分析方法

采用外標法定量并計算各種氨基酸的含量[18-19]；應用SPSS軟件對數據進行統計及student's-ttest（非成對數據比較分析）；應用xlstat軟件（2015試用版）對大曲進行判別分析。

2 結果與分析

2.1 氨基酸標準曲線的建立

混合氨基酸標準品中含有酸性、中性、堿性氨基酸及相關化合物，對混合標準氨基酸樣品分析檢測，檢測結果見圖1。由圖1可知，570 nm通道可檢測36種氨基酸及相關化合物，440 nm通道可檢測出羥脯氨酸和脯氨酸2種氨基酸。所有的氨基酸及相關化合物能夠在125 min內得到較理想的分離效果。根據標準游離氨基酸測定結果計算得到各種氨基酸的校正因子，各氨基酸質量濃度Y（mg/L）對峰面積X的標準曲線回歸方程見表1。由表1可知，相關系數R2均＞0.99，結果表明，各氨基酸質量濃度與峰面積在一定范圍內線性關系良好。

圖1 氨基酸混合標準品色圖譜Fig.1 Chromatogram of mixed amino acids standards

表1 游離氨基酸標準曲線回歸方程Table 1 Standard curve regression equation of free amino acids

2.2 大曲游離氨基酸含量分析

大曲樣品經過處理進樣后，游離氨基酸分析圖譜見圖2，從圖2可看出，峰型及分離效果良好。從拆倉大曲中共檢出氨基酸及相關化合物21種。

圖2 大曲氨基酸色圖譜Fig.2 Chromatogram of amino acids in Daqu

對白曲、黃曲和黑曲游離總氨基酸含量（不含α-氨基丁酸、γ-氨基酸丁酸）進行分析，結果見圖3。由圖3可知，不同類別拆倉大曲氨基酸總量存在極顯著差異（P＜0.01），拆倉大曲游離氨基酸總量大小順序為黑曲＞黃曲＞白曲，白曲游離總氨基酸含量為9.65 mg/g，黃曲游離氨基酸總量為10.57 mg/g，黑曲游離總氨基酸含量為12.52 mg/g。

圖3 不同類別大曲游離總氨基酸含量Fig.3 Total content of free amino acids in different types of Daqu

白曲、黃曲和黑曲中均檢測出天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸共18種氨基酸，未檢出色氨酸和瓜氨酸。根據標準曲線獲得大曲游離氨基酸的含量，白曲、黃曲和黑曲游離氨基酸（不含氨）平均含量及占比見表2。

從表2可看出，黃曲和白曲中谷氨酸含量最高，平均含量分別為1.24 mg/g、1.30 mg/g，占總氨基酸的11.51%及13.18%，其次為脯氨酸、丙氨酸。在黑曲中脯氨酸含量最高，平均含量為1.58 mg/g，占總氨基酸的12.36%，其次為丙氨酸、異亮氨酸和谷氨酸。此外，在3種大曲中均檢測出了γ-氨基丁酸，平均含量均為0.13 mg/g。

表2 不同類別大曲游離氨基酸平均含量及占比Table 2 Average content and distribution of free amino acids in different types of Daqu

在18種氨基酸中，中性氨基酸含量最高（含甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸），占游離氨基酸總量的34.89%（白曲）～38.68%（黑曲），其次為酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、雜環氨基酸（脯氨酸、組氨酸）以及芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸），含硫氨基酸含量最低。

2.3 大曲游離氨基酸差異性比較

為了進一步了解白曲、黃曲和黑曲之間游離氨基酸的差異，基于大曲游離氨基酸含量進行了student's-t test（非成對數據比較）差異性分析，結果見圖4。由圖4可知，白曲、黃曲、黑曲在不同游離氨基酸含量上存在顯著性差異（P＜0.05），大曲氨基酸差異具體為白曲和黃曲在蘇氨酸、絲氨酸上存在顯著性差異（P＜0.05），天冬氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、組氨酸和精氨酸上存在極顯著性差異（P＜0.01）。白曲和黑曲在谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和鳥氨酸含量上存在顯著性差異（P＜0.05），天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸差異極顯著（P＜0.01）。黃曲和黑曲在丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸上差異顯著（P＜0.05），天冬氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸有極顯著差異（P＜0.01）。其中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸在大曲中均隨著大曲顏色加深而上升，這幾類氨基酸在黑曲中含量最高，在白曲中含量最低。谷氨酸則呈相反趨勢，在白曲中含量最高，黑曲中含量最低，同時白曲中的組氨酸含量也顯著高于黑曲和黃曲（P＜0.05）。除了上述幾種氨基酸，黃曲的丙氨酸、苯丙氨酸含量顯著低于黑曲（P＜0.05），而黑曲的脯氨酸則顯著高于黃曲和白曲（P＜0.05）。

圖4 不同類別大曲氨基酸差異性分析Fig.4 Difference analysis of amino acids in different types of Daqu

在發酵過程中，氨基酸為酵母代謝提供氮源，氨基酸的碳骨架可參與酵母細胞內其他氨基酸或蛋白的合成[20]。天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸的碳骨架來源于糖類化合物[21]，同時脯氨酸在整個發酵過程中不能被酵母利用[22]，因此，雖然在三類大曲中這幾種氨基酸存在顯著差異，但是其初始濃度可能對釀造過程風味影響相對較小。而甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的碳骨架雖能由糖類合成，但在發酵后期主要來自于原料中的此類氨基酸，這幾類氨基酸的差異可能影響發酵過程中風味物質的形成。組氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸的碳骨架則幾乎不由糖類物質合成，完全來自于原料中相應的氨基酸，這幾類氨基酸的差異可能對酵母氮代謝產生影響并影響白酒品質。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸可作為高級醇的前體物質同時也會影響乙醇的生成[23-25]。甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸在三種大曲中均存在不同程度的差異性，可能導致三類大曲的功能存在差異并影響大曲的風味及制酒發酵過程酵母氮代謝及風味物質代謝。

2.4 判別分析

為了進一步了解游離氨基酸與大曲類別之間的關系，基于天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸含量，利用xlstat軟件對56個拆倉大曲對大曲進行判別分析，建立判別模型見圖5。由圖5可知，利用上述氨基酸能將白曲、黃曲和黑曲進行區分，分別位于不同的維度，利用該模型對大曲進行判別，判別正確率為86.79%。

圖5 不同類別大曲判別模型圖Fig.5 Discriminant model of different types of Daqu

3 結論

本研究結合感官評價分類結果對高溫拆倉大曲的游離氨基酸進行分析比較，結果表明，大曲中能檢測出天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸共18種氨基酸和活性物質γ-氨基酸丁酸，色氨酸及瓜氨酸未檢出。黑曲游離總氨基酸含量最高（12.52 mg/g），黃曲次之（10.57 mg/g），白曲最低（9.65 mg/g）。白曲、黃曲、黑曲在氨基酸含量上存在顯著性差異（P＜0.05），其中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸在大曲中均隨著發酵程度升高而上升，這幾類氨基酸在黑曲中含量最高，在白曲中含量最低。谷氨酸則呈相反趨勢，在白曲中含量最高，黑曲中含量最低，同時白曲中的組氨酸含量也顯著高于黑曲和黃曲（P＜0.05）。除了上述幾種氨基酸，黃曲中的丙氨酸、苯丙氨酸含量顯著低于黑曲（P＜0.05），而黑曲的脯氨酸則顯著高于黃曲和白曲（P＜0.05）。進一步運用xlstat軟件基于上述18種氨基酸建立判別模型，可利用氨基酸濃度對大曲類別進行有效判別。通過分析不同類別高溫拆倉大曲中游離氨基酸，為大曲分類評價標準的完善和提升提供理論基礎，并為研究大曲功能提供了新思路。