復合果醋乳飲料的研制及其對小鼠潤腸通便功能的評價

王家東，李 婧，賈玉香，張嬌嬌，杜 鵬，鄭 宇，宋 佳*

（1.信陽農林學院 生物與制藥工程學院，河南 信陽 464000；2.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

隨著社會經濟的迅速發展、工業現代化程度的提高，人們的生活節奏明顯加快。現代都市中青年普遍使用電腦辦公，工作壓力大，節奏快，夜生活不節制，經常熬夜，極易造成便秘的情況[1-4]。便秘會加重患者的思想負擔，增添焦慮緊張情緒，并對人體內環境、內分泌系統均有一定影響，日久也可能誘發或加重其他疾病，影響患者的生活質量[5-7]。因此，潤腸通便，防治大便秘結對于保持身體健康，延年益壽具有十分重要的意義。

果醋是以果實或果酒為原料，通過微生物發酵成的酸性飲料或者調味品，兼具食醋和水果的雙重營養保健功能[8]。果醋含有豐富的有機酸、氨基酸、維生素及礦物質，具有食療保健，美白護膚、抗病、抗衰老、抗疲勞等功能，被譽為“21世紀的食品”[9-13]。目前市場上的果醋多為單一品種的水果果醋，而對于采用兩種或兩種以上水果為原料釀制復合果醋的產品并不常見。如果能充分利用豐富的水果資源開發果醋及果醋飲料產品，就可以有效解決鮮果滯銷的問題，為果蔬深加工提供廣闊地發展空間[14-15]。

含果醋乳飲料的開發是近年來研究的熱點，較之于單純的傳統食醋或者果醋開發，以及單純酸性乳飲料開發，含果醋乳飲料兼具了果醋保健和酸乳營養豐富的優點[16-17]。但目前市場上含果醋乳飲料的開發主要是將發酵型的果醋和乳制品進行調配，如將成品果醋和牛奶按一定比例調配或者將發酵型蘋果醋和酸奶進行調配制成蘋果醋酸奶乳飲料。但調配型果醋乳飲料原料利用率較低，質量不穩定，風味物質損失嚴重[18-19]。

針對當前果醋乳飲料存在的問題，本研究研發一種具有潤腸通便功能的發酵型復合果醋乳飲料，以茶淀葡萄、蘋果和柚子為原料經過酒精發酵、醋酸發酵、益生菌發酵后調配成發酵型復合果醋乳飲料，并研究其對小鼠潤腸通便功能的影響，為果蔬深加工以及果醋乳產品的開發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

茶淀葡萄、蘋果、柚子、脫脂牛奶：天津市蔬菜水果批發市場；白砂糖（一級）：市售；檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉、果膠（均為食品級）：國藥集團（天津自貿區）供應鏈有限公司；阿拉伯膠（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；活性炭：廣州舒野環保材料有限公司；復方地芬諾酯片、鹽酸洛哌丁胺：長春長紅制藥有限公司。

1.1.2 菌株

巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）AS1.41：天津科技大學微生物制藥研究室；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 1012、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC 22150：中國工業微生物菌種保藏管理中心；葡萄酒酵母RW：安琪酵母有限公司。

1.1.3 動物

健康雄性昆明小鼠[體質量（20±2）g，100只]：中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK（京）2014-0013。

1.1.4 培養基

醋酸菌培養基：30 g葡萄糖、10 g酵母膏、10 g蛋白胨溶解于1 000 mL水中，于115℃條件下滅菌20 min，冷卻后在無菌條件下加入35 mL無水乙醇。

MRS乳酸菌培養基：10 g蛋白胨、10 g酵母膏、20 g葡萄糖、1.0 mL吐溫80、2 g K2HPO4、5 g醋酸鈉、2 g檸檬酸二銨、0.58 gMgSO4·7H2O、0.25 gMnSO4·4H2O溶解于1 000 mL水中，pH 6.2～6.6，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BG2004型電子分析天平：南京安鐸貿易有限責任公司；TGL-16B型高速臺式離心機：上海安亭科學儀器；WE-3型水浴恒溫振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；WYT型手持式糖度計：上海天壘儀器公司；JYL-C60T榨汁機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合果醋乳飲料加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料制漿：根據前期預實驗結果，茶淀葡萄12 kg、蘋果6 kg及柚子（含皮）3 kg破碎榨汁，添加適量抗壞血酸，以防止褐變。

酶解：于復合果汁中添加0.018 g/L果膠酶，45℃酶解2 h，在70℃鈍化酶，殺菌、冷卻待用。

酒精發酵：用蔗糖調節總糖質量濃度至250g/L，按0.2g/L的接種量接入已經用30℃1%蔗糖水溶液活化20min后的活性干酵母RW，25℃進行酒精發酵，當發酵液中的總糖質量濃度低于5 g/L時終止發酵，得到復合果酒醪液，此時酒精度為（8.5±0.5）%vol。

醋酸發酵：將酒精發酵獲得的果酒醪液中酒精濃度用純凈水稀釋至7.5%vol后，接入巴氏醋桿菌AS1.41種子液（10%接種量），30℃、180 r/min條件下進行醋酸發酵，當發酵液中的總酸含量達到（6.5±0.5）g/100 mL，終止發酵得到復合果醋醪液。

混合：將復合果醋醪液稀釋至酸度為（0.5±0.1）g/100mL后按70%的添加量加入已滅菌的脫脂生牛乳液得到混合液，經過濾、均質、滅菌備用。

益生菌發酵：混合液中接入植物乳桿菌種子液（10%接種量），42℃條件下靜置發酵3 d。

調配：發酵完成的復合果醋乳中加入（10±2）%原料果汁后，再加入蔗糖、檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉和果膠進行調配。

灌裝、成品：將調配得到的復合果醋乳經超高溫瞬時滅菌后在無菌條件下灌裝入250 mL無菌紙盒（康美包：采用PE/白紙板/PE/Al/粘合層/PE 6層復合結構），即得復合果醋乳飲料成品。

1.3.2 復合果醋乳飲料配方優化單因素試驗

為使復合果醋乳飲料在口感上更加柔和，風味上更加突出，對其配方進行優化，選取2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%蔗糖添加量調整甜度，0.25‰、0.50‰、0.75‰、1.00‰、1.25‰檸檬酸鈉添加量調節酸度，0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰果膠添加量和0.25‰、0.50‰、0.75‰、1.00‰、1.25‰羧甲基纖維素鈉添加量調節黏稠度及穩定性，調配后進行感官評價。

1.3.3 復合果醋乳飲料配方優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用4因素3水平的正交設計L9（34）優化復合果醋乳飲料配方，正交試驗因素與水平見表1。

表1 復合果醋乳飲料配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of compound fruit vinegar milk beverage

1.3.4 復合果醋乳飲料品質分析

感官評定：復合果醋乳飲料感官評分標準見表2，隨機抽取10名食品專業學生組成評分小組按照感官評分標準進行打分，取平均值作為感官評分結果，滿分100分。

表2 復合果醋乳飲料感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of compound fruit vinegar milk beverage

理化指標：蛋白質和苯甲酸含量測定參照GB/T21732—2008《含乳飲料》中方法進行[20]。

微生物測定：大腸桿菌采用菌落計數法；致病菌參照GB/T 22429—2008《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗酶聯免疫法》中的方法測定[21]。

1.3.5 潤腸通便功能評價動物試驗

參考《保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊》中規定的通便功能檢驗方法，考察復合果醋乳飲料潤腸通便的功能。

（1）動物分組及飼養

健康雄性昆明小鼠，體質量18～22g，飼養溫度（24±1）℃，相對濕度40%～60%，晝夜間隔12 h；設置空白組、模型組、高、中、低劑量組，每組20只。

（2）動物給藥方式及劑量

墨汁的配制：阿拉伯膠100 g，加水800 mL，煮沸至透明溶液，稱取活性炭粉末50 g，加入上述溶液煮沸3次，冷卻至室溫后補水至1 000 mL，4℃保存，用前搖勻。

劑量計算：按照成人（體質量按70 kg計算）每天飲用1瓶，即100 mL計算，小鼠折算劑量按人體10倍計，即小鼠每天飲用1 000 mL/70 kg，每只小鼠按20 g計，即每只小鼠每天飲用0.33 mL。

空白組受試小鼠，每天灌胃1次，每次0.33 mL生理鹽水，連續灌胃14 d；模型組受試小鼠，利用鹽酸洛哌丁胺建立便秘模型組；實驗組受試小鼠，給已建立的便秘模型組受試小鼠灌胃復合果醋乳飲料，高劑量組每天灌胃0.6 mL，低劑量組每天灌胃0.3 mL，連續灌胃14 d。

（3）小鼠小腸運動實驗

連續灌胃14 d后，各組小鼠禁食不禁水12 h；模型組和高、中、低劑量組分別灌胃給予復方地芬諾酯5 mg/kg體質量，空白組給蒸餾水；復方地芬諾酯灌胃30 min后，各組進行最后一次劑量灌胃；灌胃后空白組、模型組和高、中、低劑量組分別灌胃0.4 mL墨汁；30 min后立即處死各組受試小鼠，分離獲取幽門至盲部的腸管，拉直后分別測量腸管總長度、幽門至墨汁前沿的墨汁推進長度，并計算每只受試小鼠墨汁推進率，其計算公式為小鼠墨汁推進率=墨汁推進長度/腸管總長度×100%。

（4）小鼠排便實驗

連續灌胃14 d后，各組小鼠禁食不禁水12 h；模型組和高、中、低劑量組分別灌胃給予復方地芬諾酯5 mg/kg體質量，空白組給蒸餾水；復方地芬諾酯灌胃30 min后，各組進行最后一次劑量灌胃；灌胃后空白組、模型組和高、中、低劑量組分別灌胃0.4 mL墨汁，灌胃后各組動物單獨飼養，自由攝食攝水，并記錄自灌胃墨汁起，每只動物排首粒黑便的時間。

1.3.6 統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行數據分析，以“平均值±標準偏差”表示，多組數據比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 復合果醋乳飲料配方優化結果

以感官評分為評價指標，采用單因素試驗和正交試驗對復合果醋乳飲料調配工序中蔗糖、檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉和果膠的添加量進行優化，以期得到一種風味較好、符合大眾口味的復合果醋乳飲料。

2.1.1 復合果醋乳飲料配方優化單因素試驗

由圖1A可知，當果醋乳飲料蔗糖添加量在5.0%～10.0%時感官評分較高，蔗糖較多時，口感甜度太濃；含量較少時，酸味的刺激較明顯，酸味較重。因此，蔗糖添加量選擇7.5%較合適。由圖1B可知，當果醋乳飲料檸檬酸鈉添加量在0.50‰～1.00‰時感官評分較高，添加量過低時酸味明顯，刺激感較大；添加量較高時，口味較澀。因此，檸檬酸鈉添加量選擇1.00%較合適。由圖1C可知，當果醋乳飲料羧甲基纖維素鈉添加量在0.75‰～1.25‰時感官評分較高，此時果醋乳的體態均勻，口感潤滑；添加量過低時，產品太稀，有顆粒；添加量較高時，產品過于黏稠，無爽滑感；因此，羧甲基纖維素鈉添加量選擇1.00%較合適。由圖1D可知，當果醋乳果膠添加量在1.5‰～2.5‰時感官評分較高，組織細膩，無分層和沉淀現象；添加量較低時，產品有輕微分層現象；添加量較高時，產品澀感明顯；因此，果膠添加量選擇2.0‰較合適。

圖1 各組分添加量對復合果醋乳飲料感官品質的影響Fig.1 Effect of each component addition on sensory quality of compound fruit vinegar milk beverage

2.1.2 復合果醋乳飲料配方優化正交試驗

以感官評分為評價指標，采用L9（34）正交試驗對蔗糖（A）、檸檬酸鈉（B）、果膠（C）及羧甲基纖維素鈉（D）和的添加量進行優化，正交試驗結果與分析見表3。由表3可知，對復合果醋乳飲料影響因素由大到小的順序依次為蔗糖添加量（A）＞羧甲基纖維素鈉添加量（D）＞檸檬酸鈉添加量（B）＞果膠添加量（C）；由k值確定最優配方組合為A2B2C3D2，即蔗糖7.5%、檸檬酸鈉1.00‰、果膠2.5‰、羧甲基纖維素鈉1.00‰。在此優化配方條件下，感官評分為95分。

表3 復合果醋乳飲料配方優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for formula optimization of compound fruit vinegar milk beverage

2.2 產品質量評價

感官指標：色澤為淡紫色、液體澄清，無沉淀、口味清新，具有酸乳獨特的口感，感官評分為95分。

理化指標：乳蛋白質含量為1.3 g/100 g，苯甲酸含量為0.01 g/kg，符合GB/T 21732—2008《含乳飲料》中乳蛋白質≥1.0 g/100 g、苯甲酸≤0.03 g/kg的規定。

微生物指標：細菌總數＜100 CFU/mL，大腸桿菌＜3 MPN/100 mL，致病菌未檢出。

2.3 潤腸通便功能評價

2.3.1 復合果醋乳飲料對小鼠小腸運動的影響

復合果醋乳飲料對小鼠小腸運動的影響結果見表4。

表4 復合果醋乳飲料對小鼠小腸運動的影響Table 4 Effect of compound fruit vinegar milk beverage on small intestine movement of mice

由表4可知，與空白組相比，模型組墨汁推進率顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組墨汁推進率有顯著提高（P＜0.05），高劑量組墨汁推進率有極顯著提高（P＜0.01）。

2.3.2 復合果醋乳飲料對小鼠排便的影響

復合果醋乳飲料對小鼠排便的影響結果見表5。由表5可知，與空白組相比，模型組首次排黑便時間極顯著延長（P＜0.01）；與模型組相比，高、低劑量組首次排黑便時間極顯著縮短（P＜0.01），且高劑量組排黑便時間與空白組相近。

表5 復合果醋乳飲料對小鼠排便的影響Table 5 Effect of compound fruit vinegar milk beverage on defecation of mice

綜上所述，該發酵型復合果醋乳飲料連續灌胃14 d后，在各組動物單獨飼養，自由攝食攝水，無人為影響其活動的基礎上，模型組與空白組存在極顯著差異（P＜0.01），即復方地芬諾酯可顯著抑制空白組動物的正常排便行為。而劑量組動物的排便行為與模型組存在極顯著差異（P＜0.01），與空白組無顯著性差異（P＞0.05），結果表明，劑量組動物在復方地芬諾酯刺激后，其被抑制的排便行為得以恢復至正常水平，該結果與程陽等[22]針對羊棲菜褐藻酸鈉對便秘模型小鼠的潤腸通便的研究相符。因此，通過小鼠小腸推進實驗和小鼠排便實驗相關結果結果，表明該復合果醋乳飲料具有良好的促進潤腸通便的功能。

3 結論

本研究結合當前市場要求，首次以茶淀葡萄、蘋果、柚子和牛奶為原料，經過微生物三次發酵開發出了的一種新型的復合果醋乳飲料，通過單因素和正交試驗對該飲料的調配工藝進行優化，最終確定復合果醋乳飲料的配方為：蔗糖7.5%、檸檬酸鈉1.00‰、果膠2.5‰、羧甲基纖維素鈉1.00‰。在此優化條件下，感官評分為95分。該飲料產品在色澤、香氣和滋味等方面均能顯示其產品特色，其理化指標和微生物指標均符合國家標準。同時考察該飲料對小鼠機體潤腸通便功能的影響，進一步證明該復合果醋乳飲料具有良好的潤腸通便的功能，是一種具有開發潛力的發酵型飲品。