傳統發酵食品中乳酸菌的分離鑒定、基因分型及優良菌株篩選

李雅茹，閆裕峰，陳旭峰，王如福，許 女*

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030400；3.山西農業大學 實驗教學中心，山西 晉中 030801）

乳酸菌是可以將多種碳水化合物發酵轉化為乳酸等的一類細菌的總稱，其生長代謝對發酵食品的品質和風味有很大的貢獻[1-2]。國內學者廣泛開展了對優良乳酸菌株的篩選工作，從酸奶[3]、開菲爾粒[4]、泡菜[5]和山西老陳醋酒醪和醋醅[6]等傳統發酵食品中篩選關于產酸[6]、產乙偶姻[7]、分解亞硝酸鹽[8]、降膽固醇[9]、抗氧化[10]等益生特性的優良乳酸菌菌株。

近年來，國內外學者關于乳酸菌分型開展了一些研究工作[11]，采用的方法主要有限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）分析技術、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、擴增片段長度多態性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）分析、基因組短重復序列聚合酶聯式反應（repetitive-element polymerasechainreaction，rep-PCR）分析技術及隨機擴增多態性脫氧核糖核酸（random amplified polymorphic deoxyribonucleic acid，RAPD）技術。RANDAZZOCL等[12]采用RFLP技術與傳統生理生化鑒定相結合的方法分析了橄欖菜自然發酵過程中乳酸菌的多樣性，探明了乳酸菌類群及其變化規律。PSONI L等[13]采用PFGE技術分析了分離自希臘山羊乳奶酪中的40株乳酸乳球菌的多樣性，結果顯示40株菌具有豐富的多態性。DIMITROV Z P等[14]采用AFLP、PFGE等分子分型技術對分離自健康人體的乳酸菌進行了鑒定和多態性分析。ADIGUZEL G C等[15]利用Rep-PCR技術分析了76株分離自土耳其發酵香腸的乳酸菌，并將它們鑒定到了種和菌株的水平。

RAPD技術是建立在PCR基礎之上的一種可對基因組進行多態性分析的分子分型技術。作為PCR技術的延伸，RAPD技術有其自身的特點：退火溫度較低；模板DNA用量少；簡捷快速，安全性好；所用時間短，且能較好的對同種類的菌株進行分型，因為方法簡單快速等優勢，近年來很多學者采用此方法對乳酸菌菌株進行分型研究[16-17]。關于乳酸菌菌株分型的研究大都是型別與耐藥性的關系，關于型別與益生特性之間的關系鮮有研究。本研究主要對分離自藏靈菇、山西老陳醋酒醪和醋醅傳統發酵食品的乳酸菌進行16S rDNA鑒定、RAPD菌株基因分型及及產酸、產乙偶姻、降膽固醇、分解亞硝酸鹽及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力進行研究，探討型別與特性之間的關系，篩選優良菌株，以期為菌劑開發和傳統發酵食品品質及風味改善提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

藏靈菇（Zanglinggu，Z）：市售；山西老陳醋酒醪（Shanxi aged vinegar jiulao，SAV-JL）、山西老陳醋醋醅（Shanxi aged vinegar cupei，SAV-CP）：山西老陳醋醋廠。

1.1.2 試劑

細菌基因組提取試劑盒、MIX和Maker D：生物工程（上海）有限責任公司；細菌通用引物、基因分型隨機引物M13由華大基因（北京）股份有限公司合成；膽固醇、亞硝酸鹽、DPPH、肌酸、鹽酸萘乙二胺、鄰苯二甲醛（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基[4]、V-P培養基[7]、降膽固醇篩選培養[9]：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

T100PCR儀、Universial HoodⅡ凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；722型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統發酵食品中乳酸菌菌株的分離及鑒定

采用MRS培養基對市售藏靈菇樣品（Z）和山西老陳醋酒醪（SAV-JL）、山西老陳醋醋醅（SAV-CP）中的乳酸菌進行分離，并進行菌落形態和細胞形態觀察，用細菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組，進行16S rDNA測序及菌種鑒定，并構建系統進化樹。采用的引物[4]為：正向引物27F：5'-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-ACGGYTACCTI'GTI'ACGACTY-3'。

1.3.2 傳統發酵食品中乳酸菌菌株基因分型[18]

以分離菌株的基因組DNA為模板，采用隨機引物M13進行RAPD分型；反應體系如下：30 μL反應體系包括引物3 μL，模板3.5 μL，2×Mix 15 μL，ddH2O 10.5 μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環；72℃再延伸10 min，4℃，永遠。反應結束后擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統上觀察分析。

1.3.3 傳統發酵食品中優良乳酸菌菌株的篩選

采用MRS液體培養基，按照2%接種量接種上述分離得到的乳酸菌，于37℃靜置培養24 h后，將發酵液8 000 r/min離心10 min，取上清，用酸堿中和法[6]測定其總酸含量；用肌酸比色法[7]測定其乙偶姻含量；用鄰苯二甲醛比色法[5]測定培養前后發酵上清膽固醇含量；用鹽酸萘乙二胺光度法[8]測定培養液中亞硝酸鈉含量；參考WANG L C等[10]實驗方法測定發酵上清液DPPH自由基清除力。

2 結果與分析

2.1 傳統發酵食品中乳酸菌菌株的鑒定

從藏靈菇、山西老陳醋酒醪和醋醅中共分離得到40株乳酸菌，藏靈菇來源24株，山西老陳醋酒醪來源5株，醋醅來源11株，經過形態學觀察，典型乳酸菌的菌落形態和細胞形態描述見表1，典型乳酸菌的菌落形態和細胞形態見圖1，16S rDNA測序后構建進化樹見圖2。

表1 傳統發酵食品中乳酸菌菌株細胞及菌落形態特征Table 1 Colony and cell morphology of lactic acid bacteria in traditional fermented food

圖1 傳統發酵食品中典型乳酸菌菌株細胞及菌落形態Fig.1 Colony and cell morphology of typical lactic acid bacteria in traditional fermented food

圖2 傳統發酵食品中典型乳酸菌的16S rDNA系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of typical lactic acid bacteria in traditional fermented food based on 16S rDNA sequences

由圖2可知，菌株Z1、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z12、Z15、Z18、Z20、Z27、Z35、Z42、Z53、Z56、Z58、Z60、SAV-JL7、SAV-JL57、SAV-CP967與植物乳桿菌同屬于一個分支，通過BLAST比對，這些菌株序列與已知的多株植物乳桿菌16S rDNA的同源性最高可達99%，故鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其中藏靈菇來源17株，酒醪來源2株，醋醅來源1株；同樣，鑒定菌株Z10、Z14、SAV-JL576、SAV-CP578、SAV-CP584、SAV-CP728、SAV-CP736、SAV-CP737為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），其中2株分離自藏靈菇，1株分離自酒醪，5株分離自醋醅；鑒定菌株SAV-JL3、SAV-JL216、SAV-JL245、SAV-CP1888、SAV-CP2422、SAV-CP2426為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），均來自山西老陳醋的酒醪（3株）和醋醅（3株）；鑒定菌株Z29、Z36、Z62、Z71、Z81、SAV-CP2420為耐久腸球菌（Enterococcus durans），5株分離自藏零菇，1株分離自醋醅。

2.2 傳統發酵食品中乳酸菌菌株基因分型

采用隨機引物M13對40株乳酸菌進行PCR擴增，結果見圖3。

圖3 傳統發酵食品中乳酸菌的RAPD分型電泳圖Fig.3 RAPD genotyping electrophoresis of lactic acid bacteria in traditional fermented food

由圖3A可知，20株植物乳桿菌被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個型別，Ⅲ型又分為Ⅲ-Ⅰ、Ⅲ-Ⅱ2個亞型，其中菌株Z1、Z4、Z5、Z6、Z8、Z9、Z12、Z15、Z18、Z20、Z27、Z35、Z42、Z53為Ⅰ型，菌株Z56、Z58為Ⅱ型，菌株Z60為Ⅲ-Ⅰ型，菌株SAV-JL7為Ⅲ-Ⅱ型，菌株SAV-JL57、SAV-CP967為Ⅳ型。由圖3B可知，8株短乳桿菌呈現Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個型，菌株Z10為Ⅰ型，菌株Z14、SAV-JL576、SAV-CP578、SAV-CP584、SAV-CP728為Ⅱ型，其余菌株SAV-CP736、SAV-CP737為Ⅲ型。由圖3C可知，株戊糖片球菌呈現3個型別，菌株SAV-JL3、SAV-JL216、SAV-JL245、SAV-CP1888歸屬于Ⅰ型，菌株SAV-CP2422歸屬于Ⅱ型，菌株SAV-CP2426歸屬于Ⅲ型。由圖3D可知，6株耐久腸球菌被分為Ⅰ、Ⅱ 2個型；菌株Z29、Z36、Z62、Z71為同一個克隆型，其余菌株Z81、SAV-CP2420為一個克隆型。

綜上所述，來源于藏靈菇的24株乳酸菌，其優勢克隆型為植物乳桿菌，來源于山西老陳醋酒醪的6株乳酸菌主要為戊糖片球菌，而來源于醋醅的10株乳酸菌主要為短乳桿菌，表明分離的乳酸菌具有菌株基因多樣性，為菌株的益生特性等篩選提供了遺傳基礎。

2.3 傳統發酵食品中乳酸菌菌株產酸特性

由圖4可知，40株乳酸菌發酵液總酸含量在2.18～24.30g/L，其中植物乳桿菌SAV-JL7產酸含量最高（24.30g/L），其含量高于焦玉雙[6]從山西老陳醋大曲中分離得到的戊糖片球菌L20（16.4 g/L），不同來源的乳桿菌菌株產酸的能力顯著不同。另外，植物乳桿菌中呈現Ⅲ型菌株的總酸含量（19.45～21.98 g/L）顯著高于Ⅱ型（10.23～13.32 g/L）；同樣，耐久腸球菌中Ⅱ型菌株總酸（8.26～9.04 g/L）含量普遍高于Ⅰ型（2.40～5.99 g/L），表明同種同型別乳酸菌產酸的能力具有相似性，同種不同型別乳酸菌產酸的能力具有差異性。

圖4 傳統發酵食品中乳酸菌的產酸量Fig.4 Total acids production of lactic acid bacteria in traditional fermented food

2.4 傳統發酵食品中乳酸菌菌株產乙偶姻特性

由圖5可知，40株乳酸菌發酵液乙偶姻含量在0.14～0.54mg/mL，其中植物乳桿菌SAV-JL7（0.54mg/mL）、植物乳桿菌SAV-JL57（0.53mg/mL）和耐久腸球菌Z81（0.45mg/mL）乙偶姻含量最高。另外，植物乳桿菌Ⅲ型菌株乙偶姻含量（0.46～0.54 mg/mL）明顯高于Ⅱ型（0.14～0.18 mg/mL），耐久腸球菌Ⅱ型菌株乙偶姻含量（0.43～0.45 mg/mL）高于Ⅰ型（0.16～0.24mg/mL），表明乳酸菌產乙偶姻的能力在同種同型別菌株中存在一致性，同種不同型別菌株存在差別。

圖5 傳統發酵食品中乳酸菌的乙偶姻產量Fig.5 Acetoin production of lactic acid bacteria in traditional fermented food

2.5 傳統發酵食品中乳酸菌菌株降膽固醇特性[19]

圖6 傳統發酵食品中乳酸菌的降膽固醇能力Fig.6 Cholesterol reduction ability of lactic acid bacteria in traditional fermented food

由圖6可知，40株乳酸菌中降膽固醇能力較強的為植物乳桿菌Z9（94.09%）、植物乳桿菌SAV-JL7（91.15%），明顯高于黃穎等[20]從藏靈菇發酵乳中降膽固醇效果明顯的嗜酸乳桿菌（50.36%）和周海柱[21]從傳統泡菜里分離得到的植物乳桿菌PL5（51.67%）。另外，植物乳桿菌呈現的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個型別菌株降膽固醇能力在45.77%～94.09%，短乳桿菌呈現的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個型別菌株降膽固醇能力在45.36%～83.10%，戊糖片球菌呈現的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個型別菌株降膽固醇能力在47.50%～80.15%，耐久腸球菌呈現的Ⅰ、Ⅱ2個型別菌株降膽固醇能力在59.67%～88.34%，表明菌株降膽固醇能力同型別無明顯關系。

2.6 傳統發酵食品中乳酸菌菌株分解亞硝酸鹽特性[22]

由圖7可知，40株乳酸菌培養24h后，分解亞硝酸鹽能力集中在35.78%～74.12%，其中植物乳桿菌SAV-JL7（74.15%）和耐久腸球菌Z71（73.99%）分解亞硝酸鹽能力最強，略低于榮鳳君[23]從傳統發酵食品中分離得到的植物乳桿菌L12（90%）和程方方等[24]從新疆傳統酸馬乳中篩選得到的腸膜明串珠菌（88.91%），不同來源的乳酸菌菌株分解亞硝酸鹽的能力顯著不同，這與菌株的生境直接相關。另外，植物乳桿菌菌株分解亞硝酸鹽能力在35.78%～74.12%，短乳桿菌菌株分解亞硝酸鹽能力在43.23﹠～70.13%，戊糖片球菌菌株分解亞硝酸鹽能力在38.69%～68.42%，耐久腸球菌菌株分解亞硝酸鹽能力在43.89%～73.99%，菌株分解亞硝酸鹽與其型別無明顯關聯。

圖7 傳統發酵食品中乳酸菌的分解亞硝酸鹽能力Fig.7 Nitrite degradation rate of lactic acid bacteria in traditional fermented food

2.7 傳統發酵食品中乳酸菌菌株DPPH自由基清除能力特性

由圖8可知，40株乳酸菌DPPH自由基清除能力40.95%～92.29%，其中植物乳桿菌SAV-JL7（92.29%）、植物乳桿菌Z42DPPH自由基清除能力最強（92.08%），結果高于翰墨等[25]從傳統酸奶中分離得到一株鼠李糖乳桿菌（54.26%）。另外，植物乳桿菌中呈現Ⅲ型菌株DPPH自由基清除能力（61.82%～92.29%）顯著高于Ⅱ型（45.98%～57.33%）；相似地，耐久腸球菌中Ⅱ型菌株DPPH自由基清除能力（69.22%～72.16%）含量普遍高于Ⅰ型（56.78%～69.54%），表明同種同型別乳酸菌DPPH自由基清除能力具有相似性，同種不同型別乳酸菌DPPH自由基清除能力具有差異性。

圖8 傳統發酵食品中乳酸菌的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging capacity of lactic acid bacteria in traditional fermented food

3 結論

從傳統發酵食品中分離得到的40株乳酸菌，其中20株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），8株為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），6株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），6株為耐久腸球菌（Enterococcus durans），RAPD菌株基因分型結果發現傳統發酵食品分離得到的乳酸菌種內具有基因多樣性，同種同型別的乳酸菌產酸、產乙偶姻、降膽固醇、分解亞硝酸鹽及DPPH自由基清除能力特性具有相似性；同種不同型別的乳酸菌的特性具有差異性，結合5種特性，最終篩選出1株性能均較好的植物乳桿菌SAV-JL7，屬于植物乳桿菌Ⅲ-Ⅱ型，優良菌株可為生產菌劑的開發和發酵產品的提質增效提供參考。