紫外-光復(fù)活誘變選育發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的產(chǎn)朊假絲酵母

王 松，劉曉蘭*，江成英，鄭喜群

（1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，畜牧業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)量居世界前列，但是對(duì)于糧食和飼料在我國(guó)一直處于薄弱地位。同時(shí)，由于各種農(nóng)作物及副產(chǎn)品的處理不當(dāng)對(duì)資源與環(huán)境也造成了巨大壓力[1-3]。我國(guó)從20世紀(jì)90年代開(kāi)始研究微生物發(fā)酵飼料，大量研究表明[4-6]，微生物發(fā)酵飼料可提高原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、動(dòng)物的消化利用率等特點(diǎn)，對(duì)建立一個(gè)正常，平衡的動(dòng)物體內(nèi)微生物生態(tài)系統(tǒng)起著重要的作用。當(dāng)前，生物飼料的開(kāi)發(fā)已逐漸成為我國(guó)飼料加工的熱點(diǎn)[7]。

玉米蛋白粉作為一種重要的蛋白飼料資源含有豐富的蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)蛋白飼料生產(chǎn)中[8-10]，基于微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)特點(diǎn)，利用微生物發(fā)酵玉米蛋白粉，不僅解決了玉米蛋白粉的浪費(fèi)和吸收率問(wèn)題，由于發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的氨基酸等各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可有效提高動(dòng)物的生長(zhǎng)率[11]。

在發(fā)酵飼料行業(yè)中，產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）主要作為益生菌及飼用發(fā)酵菌劑使用，常被用于生產(chǎn)多種具有功能性的生物物質(zhì)。研究表明[12]，飼料中添加產(chǎn)朊假絲酵母，提高了仔鵝生長(zhǎng)性能，優(yōu)化了其盲腸菌群。采用產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵玉米蛋白粉，可以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。并且近年來(lái)隨著誘變育種技術(shù)的發(fā)展，相對(duì)于單一的誘變方式，復(fù)合誘變能夠更好的提高目標(biāo)微生物的各項(xiàng)功能性產(chǎn)物代謝量，如李學(xué)思等[13]從宋河大曲中酵法篩選出1株高產(chǎn)蛋白酶菌株MSPN-11，經(jīng)紫外誘變技術(shù)得1株高產(chǎn)蛋白酶菌株MSPR 8，酶活提高了26.38%。朱明軍等[14]對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌以紫外線、硫酸二乙酯為誘變劑，對(duì)其進(jìn)行兩輪復(fù)合誘變，誘變菌的發(fā)酵液酶活較出發(fā)菌提高了59.68%。本研究采用紫外-光復(fù)活誘變方式對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行處理，對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行篩選[15]，進(jìn)而得到高產(chǎn)蛋白酶的菌株，并將其應(yīng)用于發(fā)酵玉米蛋白粉飼料生產(chǎn)，可有效提高飼料利用率，降低成本，具有良好的綠色與經(jīng)濟(jì)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）：齊齊哈爾大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

無(wú)水乙醇、胰蛋白胨、瓊脂粉、碳酸鈉、酪蛋白、酪氨酸、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸等（均為分析純或生化試劑）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；脫脂牛奶：市售。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[16]：2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，100 mL水，115℃，滅菌30 min。YPD固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂；

脫脂牛奶培養(yǎng)基：A 5 g脫脂牛奶與50 mL蒸餾水混合；B 2 g瓊脂50 mL蒸餾水。A、B分別115℃滅菌20 min，冷卻至60℃混勻后倒入平板。

1.2 儀器與設(shè)備

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)；上海精密科學(xué)儀器有限公司；TV1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；北京譜析通用儀器有限公司；DSX-280不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C2109C超凈工作臺(tái)；上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種生長(zhǎng)曲線測(cè)定

采用比濁法測(cè)定出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線[17]。

1.3.2 菌懸液的制備

接種一環(huán)產(chǎn)朊假絲酵母至YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃、200 r/min培養(yǎng)20 h，得到菌懸液。

1.3.3 紫外誘變

使用紫外燈對(duì)菌懸液進(jìn)行不同時(shí)間（0～150s）的照射，每隔5s進(jìn)行一次取樣，稀釋之后進(jìn)行YPD平板涂布。將YPD平板倒扣培養(yǎng)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，繪制致死率曲線。致死率計(jì)算公式如下：

1.3.4 紫外-光復(fù)活誘變

對(duì)菌懸液采用最佳紫外誘變時(shí)間（120 s）進(jìn)行照射，然后放置白熾燈下進(jìn)行不同時(shí)間（0～30 s）的光復(fù)活照射，每隔5 s進(jìn)行一次取樣，稀釋后進(jìn)行YPD平板涂布，將YPD平板倒扣避光培養(yǎng)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算光復(fù)活率及正突變率，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 突變株的篩選

將經(jīng)紫外-光復(fù)活誘變處理后的菌懸液稀釋后涂布于脫脂牛奶平板上32℃，培養(yǎng)48 h。根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較強(qiáng)的菌株。菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值大小可以表示菌株產(chǎn)蛋白酶能力的強(qiáng)弱，該比值越大，則代表菌株產(chǎn)蛋白酶能力越強(qiáng)。

1.3.5 酶活力測(cè)定

將篩選菌株接入YPD液體培養(yǎng)基，于32℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液采用Folin-酚法測(cè)定中性蛋白酶活力。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)菌株產(chǎn)蛋白酶活力篩選出一株較出發(fā)菌株提高最大的突變株進(jìn)行連續(xù)傳代試驗(yàn)，將篩選所得菌株接入YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代5次培養(yǎng)后，取各代菌種接入液體培養(yǎng)基于32℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液采用Folin-酚法測(cè)定其中性蛋白酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線

對(duì)微生物進(jìn)行紫外誘變處理前，一般要求出發(fā)菌株應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)對(duì)紫外線照射更加敏感，易發(fā)生突變，而且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種自身代謝能力強(qiáng)，相對(duì)穩(wěn)定，生長(zhǎng)速度快繁殖旺盛[18]。以產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）作為出發(fā)菌株，接種至YPD液體培養(yǎng)于32℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)間的OD600nm值，繪制菌株生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve ofCandida utilis

由圖1可知，0～4 h期間菌體濃度幾乎無(wú)變化，此時(shí)菌種處于生長(zhǎng)延遲期。從第6小時(shí)開(kāi)始菌體濃度劇增，此時(shí)菌種進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20h后菌種生長(zhǎng)速度減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期，30 h后，隨著菌種的生長(zhǎng)緩慢，菌懸液濃度幾乎保持不變，進(jìn)入衰亡期。結(jié)果表明，出發(fā)菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為6～20 h，應(yīng)選擇對(duì)數(shù)中前期的菌種進(jìn)行紫外誘變處理。因此，選擇經(jīng)過(guò)12 h培養(yǎng)的菌液進(jìn)行紫外誘變處理。

2.2 紫外誘變處理

進(jìn)行紫外誘變育種時(shí)，為了得出最佳誘變劑量，需先對(duì)出發(fā)菌種的紫外線致死率進(jìn)行計(jì)算，產(chǎn)朊假絲酵母致死率曲線見(jiàn)圖2。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母致死率曲線Fig.2 Lethality rate curve ofCandida utilis

由圖2可知，隨著紫外線照射時(shí)間的增加，菌株的死亡率也隨之增加。產(chǎn)朊假絲酵母在紫外照射劑量為120 s時(shí)的致死率達(dá)到80%，由于致死率為80%時(shí)，紫外誘變處理的效果最佳，菌種正突變率最高。因此，采用120 s為產(chǎn)朊假絲酵母的最佳紫外誘變劑量。

2.3 紫外-光復(fù)活誘變[19]

在紫外照射120 s后放入白熾燈下進(jìn)行不同時(shí)間（0～30 s）的光復(fù)活照射，通過(guò)平板涂布法計(jì)算光復(fù)活率，并測(cè)量計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑比值，與單一誘變突變株進(jìn)行比較，通過(guò)計(jì)數(shù)透明圈直徑比大于原始菌株直徑比的菌落數(shù)，與菌落總數(shù)的比值計(jì)算正突變率，產(chǎn)朊假絲酵母光復(fù)活率及正突變率曲線見(jiàn)圖3。

圖3 產(chǎn)朊假絲酵母光復(fù)活率及正突變率曲線Fig.3 Photoreactivation rate and positive mutation rate curve of Candida utilis

由圖3可知，隨著光復(fù)活時(shí)間在0～30 s范圍內(nèi)增加，菌株光復(fù)活率也隨之由10.01%增加至32.42%。隨著光復(fù)活時(shí)間在0～30s內(nèi)的增加，正突變率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，并且在白熾燈照射劑量達(dá)到20 s時(shí)，菌株正突變率最大達(dá)到14.99%，隨后便隨著白熾燈照射時(shí)間的增加而減小。因此，確定在紫外照射120 s后，白熾燈照射20 s為最佳光復(fù)活劑量。

2.4 高產(chǎn)蛋白酶突變菌株篩選

2.4.1 紫外誘變突變株篩選

將出發(fā)菌株進(jìn)行單一紫外誘變處理（紫外照射120 s）后，將其倒扣避光培養(yǎng)于32℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較強(qiáng)的菌株，并測(cè)定其酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫外誘變突變株的初篩Table 1 Primary screening of UV mutated strain

由表1可知，出發(fā)菌株透明圈與菌落直徑比值為7.62，由于脫脂牛奶培養(yǎng)基上菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值大小可以反映菌株產(chǎn)蛋白酶能力的強(qiáng)弱，該比值越大，則代表菌株產(chǎn)蛋白酶能力越強(qiáng)。所以通過(guò)120 s的紫外線照射，篩選出較出發(fā)菌株比值提高最大的5株突變株，其中以YC-3最大達(dá)到13.11，將篩選所得5株菌株于32℃搖床培養(yǎng)48 h后測(cè)定其酶活力，得出發(fā)菌株酶活力為21.93 U/mL，突變株中以YC-3酶活力最大達(dá)到35.55 U/mL，是出發(fā)菌株酶活力的1.62倍，但提升效果較差，為更好的提高菌株產(chǎn)蛋白酶能力，對(duì)經(jīng)紫外誘變后的菌株再次進(jìn)行光復(fù)活試驗(yàn)。

2.4.2 紫外-光復(fù)活誘變突變株篩選

出發(fā)菌株的菌懸液經(jīng)過(guò)紫外照射120 s后，再經(jīng)白熾燈照射20 s，得到紫外-光復(fù)活誘變菌株，涂布于脫脂牛奶培養(yǎng)基于32℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑比值，并測(cè)定其酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫外-光復(fù)活誘變的突變株篩選Table 2 Screening of mutant strain by UV photoreactivation mutagenesis

由表2可知，YC-3的透明圈與菌落直徑比值為13.11，從測(cè)得的突變株中篩選透明圈與菌落直徑比值＞13.11的突變株。經(jīng)篩選共得出5株比值較YC-3提高最大的突變株，其中以突變株FC-20.14的比值最大為17.14。將篩選出的5株突變株分別接入YPD液體培養(yǎng)基中于32℃搖床培養(yǎng)48 h后離心取上清液測(cè)定其中性蛋白酶活力[20]，其中以突變株FC-20.14酶活力最高為64.18 U/mL。是單一紫外誘變的突變株YC-3的酶活力35.55 U/g的1.81倍，是出發(fā)菌株酶活力21.93 U/mL的2.93倍。

2.6 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將突變株FC-20.14接至YPD斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳代。連續(xù)培養(yǎng)5代后，將每代均接種于YPD液體培養(yǎng)基中，測(cè)定其中性蛋白酶活力[21-24]，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 突變株FC-20.14遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of mutant strain FC-20.14

由表3可知，對(duì)突變株FC-20.14進(jìn)行連續(xù)傳代5次，酶活力稍有降低。從第1代至第5代，酶活力變化了0.21 U/mL，變化率為0.32%，變化幅度不顯著，證明連續(xù)傳代會(huì)對(duì)突變株FC-20.14的蛋白酶活力造成一定影響，但減少程度較小，由此可得出，該突變株遺傳性狀穩(wěn)定，遺傳性能良好，可用作發(fā)酵玉米蛋白粉飼料。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)紫外-光復(fù)活誘變育種篩選出一株遺傳性狀穩(wěn)定的較出發(fā)菌株蛋白酶活力有明顯提高的產(chǎn)朊假絲酵母突變菌株FC-20.14用作微生物發(fā)酵玉米蛋白粉飼料，經(jīng)測(cè)定出發(fā)菌株經(jīng)單一紫外誘變過(guò)后，篩選出一株紫外突變株YC-3，蛋白酶活力為35.55 U/mL，較出發(fā)菌株的蛋白酶活力提高了0.62倍。經(jīng)紫外-光復(fù)活誘變處理后，篩選出一株紫外-光復(fù)合突變株FC-20.14，該突變株透明圈直徑與菌落直徑比值為17.14，蛋白酶活力為64.18U/mL，較出發(fā)菌株提高1.93倍。通過(guò)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連續(xù)傳代5次后該突變株蛋白酶活力變化率為0.32%，變化幅度不顯著，證明其擁有穩(wěn)定的遺傳性能，可用于發(fā)酵玉米蛋白粉飼料，為發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的研究奠定了基礎(chǔ)。