超聲-乙醇法提取鐵皮石斛花總黃酮及其體外抗氧化性的研究

繆園欣，廖明星，孫愛紅，丁文文*

（1.荊楚理工學院 生物工程學院，湖北 荊門 448000；2.湖北省荊門市畜牧獸醫局，湖北 荊門 448000；3.荊楚理工學院 醫學院，湖北 荊門 448000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）具有“益胃生津、厚腸胃”的功效，在《神農本草經》中被譽為“滋陰圣品”[1]。對鐵皮石斛化學成分研究發現其含有多糖[2]、氨基酸[3]、芪類[4-5]、生物堿[6]、黃酮[7]等成分。對鐵皮石斛藥理活性研究，發現其具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射、調節免疫等功效[8-10]。鐵皮石斛主要以莖作為藥用部位，而其他部位未被藥用，造成了極大的浪費[1]。對鐵皮石斛花的成分和功能進行研究，發現其具有和莖相似的成分和功效[11-12]。黃酮類物質廣泛存在于植物中[13]，對高血脂、高膽固醇等慢性疾病具有治療和預防作用，此外還具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等活性[14-15]。目前，對鐵皮石斛黃酮的研究主要集中在莖和葉中的黃酮，而對石斛花中黃酮報道較少[16-17]。

植物黃酮提取方法有加熱提取法、有機溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取[18]等。其中超聲提取法具有溶劑用量少、提取速度快、提取效率高等特點[19-20]。因此本實驗采用超聲-乙醇法對鐵皮石斛花總黃酮提取工藝進行優化，并對鐵皮石斛花總黃酮的體外抗氧化性進行研究，為開發利用鐵皮石斛花提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛花：湖北洲和生態農業發展有限公司；蘆丁標準品（色譜純）：南京杜萊生物科技有限公司；水楊酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；亞硝酸鈉、硫酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠；無水乙醇（分析純）：武漢中南化工試劑有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）（分析純）：Sigma公司；試驗用水為離子交換水。

1.2 儀器與設備

DZF真空干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；TY-1901型分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；YJ1002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；TG16-WS型低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；KQ-100KDB型高功率數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

取鐵皮石斛花于60℃烘箱中烘干，然后用萬能粉碎機粉碎，經40目篩子得石斛花粉末備用。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

稱取20 mg于105℃干燥至質量恒定的蘆丁標準品，置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇完全溶解定容，得質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準液。分別吸取蘆丁標準液0、1.5 mL、3.0 mL、4.5 mL、6.0 mL、7.5 mL、9.0 mL、10.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5%Na2NO21 mL，搖勻，靜置7 min。加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻靜置7 min。加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，搖勻靜置12 min后用體積分數為60%乙醇定容至刻度，靜置10 min，于波長510 nm處測吸光度值。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 鐵皮石斛花總黃酮的測定

精密稱取鐵皮石斛花粉1 g，按不同的料液比加入不同體積分數乙醇，在100 W超聲功率下超聲輔助提取一定時間。提取完成后濃縮至20 mL，再用60%乙醇定容至50 mL得總黃酮提取液，按1.3.2的方法操作測得總黃酮濃度，并依據下列公式計算得出總黃酮提取率：

式中：C為石斛花樣品中總黃酮的質量濃度，mg/mL；V為樣品溶液稀釋液體積，mL；N為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.3.4 鐵皮石斛花總黃酮提取工藝優化試驗

（1）料液比對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000 g樣品，分別按1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g∶mL）的料液比加入體積分數70%的乙醇，室溫浸泡18 h，于40℃條件下100 W超聲處理40 min。提取結束后濃縮、定容，測定吸光度值，并計算石斛花總黃酮得率。

（2）乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000 g樣品，按1∶35（g∶mL）的料液比分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，室溫浸泡18 h，于40℃條件下100 W超聲處理40 min。提取結束后濃縮、定容，測定吸光度值，并計算石斛花總黃酮得率。

（3）超聲時間對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000g樣品，按1∶35（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，室溫浸泡18h，于40℃條件下100W超聲處理10min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min。提取結束后濃縮、定容，測定吸光度值，并計算石斛花總黃酮得率。

（4）超聲溫度對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000 g樣品，按1∶35（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，室溫浸泡18 h，分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件下100W超聲處理40min。提取結束后濃縮、定容，測定吸光度值，并計算石斛花總黃酮得率。

1.3.5 提取工藝優化正交試驗設計

為了確定最佳提取條件，在單因素試驗的基礎上，以石斛花總黃酮提取率為評價指標，設計L9（34）正交試驗，對料水比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度4個因素在3個不同水平上進行優化試驗，因素與水平見表1。

表1 總黃酮提取工藝條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.6 鐵皮石斛花黃酮體外抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除能力測定

取0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL、10.0 mg/mL的鐵皮石斛花總黃酮溶液各3 mL于試管中，分別加入1.0 mL 0.1 mmol DPPH無水乙醇溶液，充分混勻后避光反應30 min，于波長517 nm處測定吸光度值為Ai，VC作陽性對照；對照組以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度值Aj；空白組以蒸餾水代替總黃酮溶液，測定吸光度值為A0[21]。

（2）羥基自由基清除能力測定

取0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的石斛花總黃酮溶液各3mL，加入1.0 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵、1.0 mL 10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入1 mL 6 mmol/mL過氧化氫，置于37℃反應10 min，于波長510 nm處測吸光度值Ai。以VC作為陽性對照，蒸餾水代替水楊酸測吸光度值Aj，空白對照以2.0 mL蒸餾水代替石斛花總黃酮溶液測定吸光度值A0[22]。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線及回歸方程

以蘆丁標準液質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

根據圖1，求得回歸方程A=8.7361C-0.0024，相關系數R2為0.999 4，表明在該濃度范圍內蘆丁濃度與吸光度線性關系良好。

2.2 鐵皮石斛花總黃酮提取單因素試驗結果與分析

2.2.1 料液比對鐵皮石斛花總黃酮提取率的影響

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，料液比在1∶20～1∶35范圍內，隨著體積分數70%乙醇溶液使用量的增加，細胞壁內外濃度差增加，細胞內有效成分易滲出，石斛花總黃酮提取率增加；此后，繼續增加溶劑用量，由于空化泡吸收的超聲波能量減少，細胞壁破裂不完全不利于提取溶出[20]，總黃酮提取率呈下降趨勢。因此，鐵皮石斛花總黃酮提取時的最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

2.2.2 乙醇體積分數對鐵皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖3可知，乙醇體積分數在40%～80%范圍內，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮提取率呈增加趨勢；當乙醇體積分數超過80%時，由于醇溶性雜質溶出量增加，總黃酮提取率降低。因此，乙醇體積分數選擇80%較為適宜。

圖3 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 超聲時間對總黃酮提取率的影響

圖4 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，超聲時間在10～40 min范圍內，鐵皮石斛花總黃酮提取率隨超聲時間的延長而增加；當超聲時間超過40 min時，由于長時間的熱效應和機械效應破壞了部分黃酮結構，黃酮提取率下降[23]。因此，鐵皮石斛花總黃酮提取的最佳超聲時間為40 min。

2.2.4 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

圖5 超聲溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，超聲溫度在30～40℃范圍內，隨著超聲溫度的升高，乙醇容易向石斛花粉內部滲透，利于有效成分浸出，鐵皮石斛花總黃酮提取率逐漸增加；此后，繼續升高溫度，部分黃酮在高溫作用下結構受損[24]，總黃酮提取率下降。因此，選擇溫度40℃為最佳超聲溫度。

2.3 提取工藝優化正交試驗

為確定最佳提取條件，在單因素試驗的基礎上，研究乙醇體積分數、料液比、超聲溫度、超聲時間對鐵皮石斛花總黃酮提取的影響，以石斛花總黃酮提取率為評價指標，進行L9（34）正交試驗。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

通過表3中提取率的極差分析結果可知，影響提取率的各因素主次順序為乙醇體積分數＞超聲溫度＞超聲時間＞料液比。從k值得出使石斛花總黃酮提取最佳的工藝條件為A2B2C2D3，即乙醇體積分數80%，料液比1∶35（g∶mL），超聲溫度40℃，超聲時間50min，在此條件下石斛花總黃酮提取率最高，為2.31%。由表3方差分析結果可知，因素A、C對石斛花總黃酮提取率有極顯著影響（P＜0.01），因素B、D對石斛花總黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），對總黃酮提取率影響的主次順序為A＞C＞D＞B，即乙醇體積分數＞超聲溫度＞超聲時間＞料液比，與直觀分析結果一致。

2.4 鐵皮石斛花總黃酮體外抗氧化活性測定

2.4.1 清除DPPH自由基能力的測定

圖6 石斛花總黃酮對DPPH·清除率曲線Fig.6 Scavenging curves of total flavonoids from Dendrobium officinaleflowers on DPPH·

由圖6可知，石斛花總黃酮對DPPH自由基的清除率呈現濃度依賴性，隨著總黃酮濃度的增加，清除率增加；質量濃度在0～2 mg/mL范圍內，石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率顯著低于VC，VC質量濃度為0.5 mg/mL時DPPH自由基的清除率就達到90.35%，而此時石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率僅為39.37%，繼續增加VC含量其DPPH自由基的清除率無顯著變化，而石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率呈濃度依賴性變化，質量濃度達2 mg/mL時，石斛花黃酮的清除率達到82.98%。質量濃度在2～10 mg/mL范圍內，VC的DPPH自由基的清除率依舊無顯著變化，石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率緩慢趨近VC的清除率，當質量濃度為10 mg/mL時石斛花黃酮的DPPH自由基的清除率達89.77%。

2.4.2 清除羥自由基能力的測定

圖7 石斛花總黃酮對·OH清除率曲線Fig.7 Scavenging curves of total flavonoids from Dendrobium officinaleflowers on·OH

由圖7可知，石斛花總黃酮對羥自由基的清除率具有濃度依賴性，清除率隨濃度的增加而增加，質量濃度在0～10 mg/mL范圍內，石斛花黃酮的羥自由基清除率顯著低于VC，VC質量濃度為0.5mg/mL時羥自由基清除率為90.26%，而此時石斛花黃酮的羥自由基清除率僅為11.29%，進一步的提高質量濃度，VC的羥自由基清除率無顯著變化，石斛花黃酮的羥自由基清除率呈濃度依賴性變化，當質量濃度為10 mg/mL時石斛花黃酮的羥自由基清除率達80.01%。

3 結論

本研究探討了鐵皮石斛花總黃酮的提取工藝，結果表明，各因素影響鐵皮石斛花總黃酮提取率的主次順序為：乙醇體積分數＞超聲溫度＞超聲時間＞料液比。通過單因素試驗及正交試驗確定超聲波乙醇法提取鐵皮石斛花總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數80%，料液比1∶35（g∶mL），超聲溫度40℃，超聲時間50 min，在此條件下鐵皮石斛花多糖提取率為2.31%。對超聲波乙醇法提取的鐵皮石斛花總黃酮進行DPPH自由基清除率和羥自由基清除率測定，發現質量濃度在0～10 mg/mL范圍內鐵皮石斛花總黃酮的自由基清除率具有濃度依賴性，當質量濃度達10 mg/mL時，其清除率分別為89.77%和80.01%，因此石斛花黃酮有較好的抗氧化活性。這為鐵皮石斛花的深入研究及開發利用提供了一定的理論參考。