液相色譜-串聯質譜測定食醋中生物胺含量

魏泉增，湯 雅，李偉民

（1.許昌學院 食品與生物工程學院，河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室，河南 許昌 461000）

食醋是我國重要的調味品，有兩千多年的悠久歷史。釀造的地理環境、原料與工藝的差異，生產出具有不同風味的食醋。釀造食醋的原料有大米、小麥、高粱、小米、麩皮、含糖分的果類等[1]。在微生物氨基酸脫羧酶作用下將氨基酸脫羧生成生物胺，通過氨基化和轉胺作用也能使醛和酮轉化為生物胺[2]。適量生物胺可促進人體的正常生理活動，但生物胺的濃度超過一定的限度會對人體產生嚴重的危害[3-4]，損傷人體的神經系統和心血管系統。因此，建立快速簡便地檢測食醋中生物胺含量的方法，對保證食醋食用安全具有重要意義。

由于生物胺分子中缺少發色基團，無紫外吸收、也無熒光及電化學活性，因此，分離及測定各類生物胺的含量存在一定的困難。目前，檢測生物胺的方法主要為衍生化-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]法。也有用生物傳感器法[8]、毛細管電泳法[9]、薄層色譜法[10]等測定食品中生物胺。唐晗等[11]利用化學發光傳感器檢測食品中生物胺含量。劉方震[12]利用毛細管電泳技術檢測尿樣、醬油等樣品中的生物胺，分離速度快、效能高并且消耗樣品量極少，但選擇性差。李燕君[13]改良了傳統的薄層色譜檢測方法并成功定性、定量檢測黃酒中生物胺的含量。黃祖新[14]采用高效液相色譜法檢測了福建紅曲醋中各生物胺含量。瞿鳳梅等[15]采用丹磺酰氯衍生化結合HPLC的方法檢測泡菜中的生物胺含量。HPLC方法是常用的檢測方法，但需要進行柱前或柱后衍生，具有反應條件苛刻、衍生產物不穩定及前處理耗時較長等不足。本研究采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法測定食醋中多種生物胺的含量，為食醋企業提供可靠數據，以期控制食醋生產過程中生物胺的產生，保證食醋的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋樣品均購買于許昌市時代廣場，樣品1，老陳醋（山西）；樣品2，黑米醋（廣東）；樣品3，老陳醋（山西）；樣品4，老陳醋（江蘇）；樣品5，香醋（上海）；樣品6，老陳醋（山西）；樣品7，香醋（江蘇）；樣品8，香醋（江蘇）。

精胺、亞精胺、酪胺、組胺二鹽酸鹽、腐胺、尸胺、色胺：阿拉丁公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）：美國西格瑪公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6460型串聯三重四極桿質譜儀、Agilent 1290型液相色譜儀：美國安捷倫公司；Mili-Q型超純水儀：密理博公司；ME104T/02電子天平：梅特勒-托利多集團。

1.3 方法

1.3.1 生物胺標準系列溶液的配制

7種生物胺標準儲備溶液制備：分別稱取色胺3.4 mg、酪胺2.6mg、組胺二鹽酸鹽3.4mg、精胺5.1mg、亞精胺4.6mg、腐胺1.8 mg、尸胺1.7 mg于10 mL的容量瓶中，定容，配成340 mg/L（色胺）、260 mg/L（酪胺）、205 mg/L（組胺）、510 mg/L（精胺）、460 mg/L（亞精胺）、180 mg/L（腐胺）、170 mg/L（尸胺）標準儲備溶液。使用超純水將混合標準溶液按1∶2的稀釋度稀釋成系列濃度標準溶液。

1.3.2 樣品的前處理

準確量取1mL各品牌的食醋樣品，超純水定容至10mL，0.45 μm濾膜過濾，直接進樣分析。

1.3.3 色譜條件與質譜條件

色譜條件：Agilent XDB-C3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30℃，進樣量5μL，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%的甲酸乙腈溶液；0～5 min時，5%～20%的B溶液；流速為0.3mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源（electrosprayionization，ESI），正離子掃描；干燥氣為氮氣（N2），干燥氣溫度為300℃，干燥氣流量為8 L/min；霧化氣壓力為30 psi，鞘氣溫度為300℃，鞘氣流量為11 L/min；毛細管電壓為4000 V（正離子模式）；錐孔電壓為500V（正離子模式）；檢測方式為多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。

取生物胺標準品，進行子離子優化。母離子為M+1，毛細管出口電壓50～150 V，步長為5 V，碰撞能量5～50 V，步長為4 V，加速電壓為4 V。

1.3.4 數據處理

定性分析：在相同的色譜和質譜條件下，對照7種生物胺標準品定性離子，以及出峰時間，對樣品中各生物胺進行定性分析。

定量分析：通過不同生物胺定量離子的峰面積，根據7種生物胺標準曲線的回歸方程，計算食醋樣品中各生物胺的含量。

試驗結果采用Minitable（17.0版）計算平均值與相關性分析[16]。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇結果

生物胺是一類具有生物活性的小分子堿類化合物，極性較大，因此，實驗中選用C3柱，以此實現7種生物胺的分離和檢測。優化后的子離子見表1，加速電壓為4V。其中，豐度最大為定量離子，豐度次大為定性離子。5min內7種生物胺全部岀峰（見圖1）。生物胺色譜出峰順序為亞精胺、腐胺、尸胺、組胺、精胺、酪胺、色胺，出峰時間分別為0.959min、0.996 min、1.004 min、1.012 min、1.098 min、1.892 min、4.064 min。

圖17 種生物胺dMRM色譜圖Fig.1 Chromatogram of dMRM for 7 kinds of biogenic amines

2.2 標準曲線回歸方程、檢出限和定量限

按照各標準品峰面積（y）對相應的標準溶液質量濃度（x）作標準曲線，得到標準曲線的回歸方程及相關系數。以信噪比（S/N）=3作為檢出限，信噪比（S/N）=10作為定量限，7種生物胺的最低檢出限見表2。各生物胺線性回歸方程在0.50～20 mg/L范圍內，線性相關系數R2均≥0.990，符合測定的要求。結果表明，該方法對生物胺靈敏度高，可以滿足樣品測定的要求。

表2 生物胺標準曲線的回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限Table 2 Regression equations of the standard curve,correlation coefficients,linearity range and limits of detection of biogenic amines

2.3 方法的回收率

方法的回收率試驗結果見表3。從表3可看出，7種生物胺的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.31%～3.29%，表明具有良好的重復性，7種生物胺的回收率也均在91.1%～102.17%。可見該方法回收率高，可用于檢測食醋中生物胺的含量。

表3 生物胺的加標回收率結果Table 3 Results of recovery rate of biogenic amines

2.4 8種食醋樣品中生物胺的測定

不同品牌食醋中的生物胺含量見表4。

表4 食醋中的生物胺含量Table 4 Contents of biogenic amines in vinegar samples mg/L

生物胺的種類和含量因食醋的品種和制作方法的不同而有所差別，由表4可知，本研究的每一個樣品中至少含有4種生物胺，所有樣品中均未檢出色胺，表明在酸性條件不利于色胺的形成。少部分食醋樣品中未檢出組胺和酪胺。

食醋中不同生物胺的含量見圖2。由圖2可知，8種樣品中亞精胺的平均含量高于其他生物胺的平均含量，除色胺外，組胺的平均含量最低。精胺、亞精胺、腐胺和尸胺是食醋中主要的生物胺，所有樣品中都能檢出上述4種生物胺，組胺、酪胺和色胺的檢出率分別為75%、87.5%和0%。已知7種生物胺毒性最強的是組胺[17]，而食醋中組胺的含量并不高，表明食醋的低pH抑制了組胺的形成。

圖2 食醋中不同生物胺含量Fig.2 Contents of different biogenic amines in vinegar samples

不同種類食醋樣品中生物胺含量測定結果見圖3。由圖3可知，陳醋、米醋和香醋3類食醋樣品中6種生物胺的含量有明顯差別。香醋中6種生物胺含量均高于陳醋和米醋，陳醋次之，米醋各生物胺含量最低。3類食醋中總生物胺含量的變化也較大，其中陳醋中總生物胺含量為77.58 mg/L，米醋總生物胺含量為13.48 mg/L，香醋的總生物胺含量為150.87 mg/L，這可能是與3類食醋的生產工藝和微生物種類不同有關。

圖3 不同種類食醋樣品中生物胺含量Fig.3 Contents of biogenic amines in different kinds of vinegar samples

2.5 樣品中生物胺含量的相關性分析

為尋找生物胺相互之間的關系，采用Minitable軟件對食醋中不同種類生物胺含量之間的相關性進行分析，結果見表5。由表5可知，組胺除了與酪胺顯著相關外（P＜0.01），與其他5種生物胺之間均沒有顯著相關性（P＞0.01）；腐胺與尸胺之間具有顯著相關性（P＜0.01），與其他5種生物胺也均沒有顯著相關性（P＞0.01）。其他生物胺之間沒有顯著的相關性（P＞0.01）。原因可能是不同釀造工藝中產生的游離氨基酸含量不同，各底物濃度之間沒有相關性；產脫羧酶具有多種底物[18-19]，如一些乳桿菌（Lactobacilli）發酵可生成組胺、酪胺，這就造成了酪胺和組胺具有一定的相關性，而腸桿菌科（Enterobacteriaceae）微生物則有同時生成腐胺和尸胺的能力[20]。一些外界因素也會影響組胺的形成，此外，溫度也會影響生成生物胺各個不同的組分，如合成組氨酸脫羧酶的最適溫度為30℃，產生組胺的嗜溫細菌生存所需要的溫度須高于14℃，低溫冷藏不利于組胺的形成。

表5 生物胺各組分之間的相關性Table 5 Correlation between components of the biogenic amines mg/L

3 結論

采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定8種食醋品牌中7種生物胺含量，所有樣品中均檢出精胺、亞精胺、腐胺和尸胺，酪胺和組胺存在于大多數食醋中，部分樣品中未檢出，此外，食醋樣品中均未檢出色胺。結果表明，食醋中所含生物胺的種類及含量因食醋的品種而異，除色胺外，其他6種生物胺總量的范圍為47.88～244.58mg/L，亞精胺，腐胺和酪胺的含量較高。組胺與酪胺，腐胺與尸胺含量具有顯著的相關性。