氯霉素單克隆抗體制備以及化學發光檢測試劑盒的研制

吳小勝，焦 強，萬宇平，王兆芹，王琳琛，叢倩千，朱亮亮，何方洋

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.河南省口岸食品檢驗檢測所，河南 鄭州 450003；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206）

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素，價格低廉，應用效果較好，對細菌有很好的抑制作用，曾經在漁、牧業中應用廣泛。由此導致相應的動物源性食品受到了氯霉素污染，通過食物鏈被人體攝入，可能引發多種疾病[1-5]。

國際食品學界將氯霉素列為禁藥，歐盟、美國等均規定了氯霉素殘留限量標準為不得檢出。歐盟“2002/657/EC”標準規定，氯霉素在動物源性食物中的最大檢出限是0.3 μg/kg[6]。我國農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定了氯霉素在所有食品動物的可食用組織中不得檢出，并將其從《中國獸藥典》中刪除，列為禁藥。我國規定氯霉素不得檢出，目前，檢測氯霉素的方法有物理化學法和免疫化學法等[7-10]，前者包括高效液相色譜法[11-13]、質譜法[14-16]等，后者主要為酶聯免疫法[17]。化學發光免疫法[18]具有檢測速度快、自動化程度高、特異性好、穩定可靠等優勢[19-20]。與酶聯免疫法和理化檢測方法相比，檢測限高幾個數量級。化學發光檢測方法具有明顯的成本優勢，更加適宜于基層實驗室的大批量樣本檢測。因此，本研究通過制備出檢測魚肉和蝦肉中氯霉素的化學發光檢測試劑盒，為基層實驗室提供選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素標準品：北京標準物質研究中心；甲醇、鈀炭催化劑、二甲基甲酰胺、氯甲酸異丁酯、尿素、淀粉碘化鉀試紙、卵清蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、魯米諾：北京百欣試劑公司；10kg草魚肉和10 kg對蝦肉：城北批發市場；發光底物液、復溶工作液、小鼠脾細胞：北京勤邦生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HMC-D2全自動化學發光免疫分析儀：北京勤邦生物技術有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原制備

（1）半抗原的制備

將30 mg氯霉素溶于甲醇中，加入5%的鈀炭催化劑（Pd/C），通入氫氣，保持一定壓力，室溫反應2 h，過濾（5 mL針筒中加棉花和濾紙，壓濾）除去Pd/C，蒸干溶劑得到淡黃色黏稠液體，既得氯霉素半抗原。Pd/C與氯霉素的摩爾比為1∶10。將上述得到的目標物在0～5℃條件下，用1 mol/L鹽酸調pH值為1～2，攪拌下滴加0.1～1 mol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀試紙變藍，再滴加0.1～1 mol/L尿素溶液，使淀粉碘化鉀試紙變淺藍，再加0.1～1 mol/L的NaOH溶液調pH值為7～9，得到清液作為溶液A備用。

稱取71.5 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于5mL0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液中，4℃預冷。用1mol/LNaOH調BSA的pH至8。將配制好的溶液A液迅速加入BSA中，4℃攪拌反應4 h。氯霉素半抗原的合成路線見圖1。

圖1 氯霉素半抗原合成路線Fig.1 Synthesis route of chloramphenicol hapten

（2）免疫原的制備

取氯霉素半抗原30 mg，用1.5 mL水溶解，得到（I）液；取50%的戊二醛（glutaraldehyde，GA）水溶液10 μL加入（I）中，室溫下攪拌反應18 h，得到（II）液；用1.5 mL水稀釋100 mg BSA，將其加至（II）液中；反應過夜，再加入24 mg NaBH4，反應3 h；最后用三蒸水透析48 h，即得免疫原。

1.3.2 單克隆抗體制備

將1.3.1得到的氯霉素免疫原免疫小鼠，制備氯霉素單克隆抗體[21]。

1.3.3 試劑盒檢測方法

配制質量濃度依次為0、0.025 μg/L、0.1 μg/L、0.4 μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L的氯霉素標準品，用全自動化學發光免疫分析儀繪制標準曲線，計算檢測結果。

1.3.4 魚肉和蝦肉樣本的前處理方法

用均質器均質樣本；稱取3.0±0.05g均質后的樣本，加入6 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，混勻；3 000×g，室溫（20～25℃）離心5 min；取2 mL乙酸乙酯相至8 mL玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL正己烷，渦旋30 s，再加入1 mL復溶液，渦旋1 min，混勻，3 000×g，室溫（20～25 ℃）離心5 min；除去上層有機相，取下層水相用于分析。

1.3.5 檢測性能

（1）檢測限

測定20份魚肉和蝦肉空白樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標準差，計算檢測限（limit of detection，LOD）[22]。

（2）精密度和準確度

我國農業部發布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定了氯霉素在動物性食品中禁止檢出。參考《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定，即對于禁用藥物，添加濃度至少為1倍定量限和2倍定量限。因此，本研究分別對魚肉樣本添加氯霉素，使其質量濃度達到0.05 μg/kg、0.1 μg/kg和0.2μg/kg，測定回收率，用來評價準確度。另外，每個樣本做4個平行，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），用來評價精密度。

（3）穩定性測定

將試劑盒放置于4℃保存，每月測定一次魚肉樣本的回收率和半抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50），連續測定12個月。

（4）抗體特異性測定

選擇氯霉素的結構類似物：棕櫚氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺，檢測氯霉素及其類似物的IC50，根據交叉反應率公式計算該試劑盒對于棕櫚氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反應率，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 半抗原鑒定

利用核磁共振氫譜法測定1.3.1制備的半抗原，化學位移δ=6.27 ppm的吸收峰為氯霉素硝基還原成氨基的氫吸收峰，如圖2所示，該信號的出現說明半抗原合成成功。由于各個核磁儀器的場強不同，對同一樣品測出的“絕對”頻率位移也會不一樣。

圖2 氯霉素半抗原核磁共振氫譜Fig.2 1H NMR of chloramphenicol hapten

2.2 標準曲線

配制質量濃度依次為0、0.025μg/L、0.10μg/L、0.40μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L的氯霉素標準品，利用全自動化學發光免疫分析儀測定空白溶液吸光度值B0及各樣品吸光度值B，結果見圖3。

圖3 氯霉素標準曲線Fig.3 Standard curve of chloramphenicol

由圖3可知，標準曲線的線性范圍為0～6.4 μg/L，經回歸擬合得到標準曲線方程為y=-1.9518x-1.4909，R2=0.9985，IC50為0.187 μg/L，檢測靈敏度為0.025 μg/kg。

2.3 檢測限

通過測定20個魚肉空白樣本中氯霉素質量濃度，根據1.3.5計算檢測限，結果見表1～2。

表1 魚肉空白樣本檢測限測定結果Table 1 Detection limit results of blank sample of fish μg/kg

表2 蝦肉空白樣本檢測限測定結果Table 2 Detection limit results of blank sample of shrimp μg/kg

由表1～表2可知，測定20個魚肉樣本中氯霉素平均值為0.018μg/kg，標準偏差為0.010μg/kg，檢測限為0.047μg/kg；測定20個蝦肉樣本中氯霉素平均值為0.019 μg/kg，標準偏差為0.009 μg/kg，檢測限為0.045 μg/kg。

2.4 精密度

根據1.3.5，測定添加0.05 μg/kg、0.1 μg/kg和0.2 μg/kg質量濃度的氯霉素魚肉樣本，用來評價精密度和準確度，試驗結果見表3。

表3 魚肉加標回收率及精密度試驗Table 3 Standard recovery and precision tests of fish sample

由表3可知，用試劑盒檢測魚肉中氯霉素的回收范圍在83.5%～109.3%之間，批內相對標準偏差范圍是5.0%～9.3%；批間相對標準偏差范圍是7.0%～7.5%。批內批間相對標準偏差均＜10%，說明試劑盒準確度及精密度較好。

2.5 穩定性

4℃下儲存試劑盒，每月檢測一次IC50和回收率，用來評價試劑盒穩定性，結果見表4。

表4 試劑盒在4℃保存的穩定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

由表4可知，測定無添加氯霉素試劑盒的IC50范圍是0.123～0.243 μg/L，回收率范圍在83.7%～106.6%之間，兩項指標均在正常范圍之內。4℃條件下試劑盒能夠保存12個月。

2.6 抗體特異性的測定

氯霉素抗體與棕櫚氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反應率見表5。

表5 交叉反應率試驗Table 5 Cross reaction rate tests

由表5可知，氯霉素抗體與棕櫚氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反應率均＜1%，說明氯霉素抗體特異性較好。

2.7 討論

通過酶聯免疫方法檢測氯霉素居多，而化學發光檢測方法應用于快速檢測行業尚不成熟，因此，本研究具有一定的研究價值。陳霞等[9]研究發現，高靈敏度酶聯免疫法對動物源性產品中氯霉素的檢測限在0.1 μg/kg以下，沒有本研究的試劑盒靈敏。

3 結論

本研究通過制備抗氯霉素單克隆抗體，研發出檢測水產品中氯霉素的化學發光試劑盒，試劑盒的標準曲線范圍為0～6.4 μg/L，對魚肉和蝦肉的檢測限分別為0.047 μg/kg和0.045 μg/kg；回收率（魚肉）是83.5%～109.3%，批內相對標準偏差范圍是5.0%～9.3%，批間相對標準偏差范圍是7.0%～7.5%。特異性良好，氯霉素單克隆抗體與棕櫚氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反應率均＜1%。化學發光試劑盒在4℃下保存12個月，IC50和回收率指標均正常，穩定性較好。