EsWnt-4基因的表達分析

劉志強，馮建彬，邱高峰

（上海海洋大學，農業部淡水產種質資源重點實驗室，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306）

調控果蠅（Drosophila melanogaster）幼體體節發育的 Winless基因［1］和小鼠（Mus musculus）乳腺瘤整合過程中發揮調控作用的int-1基因［2］屬于同源基因，兩類基因統稱為 Wnt基因［3］。Wnt基因是一個大的基因家族［4］，Wnt-4基因是 Wnt家族重要的成員［5］，目前已在哺乳類［6-7］，鳥類［8］、魚類［9］、兩棲類［5］、爬行類［10］、軟體動物［11-12］等物種中均有發現。并且實驗證實其編碼的WNT-4蛋白在許多生物事件中都發揮著重要的作用，如在雌性哺乳動物中WNT-4能夠抑制性腺分泌雄性激素，從而導致雌性個體內雄性生殖細胞的分化，當雌性個體內Wnt-4基因缺失或突變后會導致繆勒氏管缺失和雄性化［6］。在雄性個體胚胎發育時，Wnt-4的過表達會使個體雄性激素分泌降低而導致睪丸發育受到影響，個體雌性化發育［7］；在鳥類和魚類中，Wnt-4在發育的腦組織中高表達，并且能夠抑制細胞的遷移［13-14］；在果蠅中，Wnt-4被證實能夠調節視網膜成像的特異性［15］；而在一些軟體動物中，Wnt-4在不同組織中均有表達的特征［11-12］，說明其可能參與軟體動物的多種生命活動。

Wnt-4作為重要的調控因子，在許多生物中已有深入的研究，但是迄今為止在蝦蟹等甲殼類生物中尚未見Wnt-4基因的報道。本實驗從中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）卵巢組織的轉錄組數據庫中篩選獲得了中華絨螯蟹EsWnt-4基因的cDNA序列，然后對該基因在中華絨螯蟹不同組織的表達情況進行了RT-PCR檢測，最后對該基因在不同發育時期的胚胎、幼體及仔蟹中的表達量進行了分析，以期為中華絨螯蟹EsWnt-4基因的功能研究及其它蝦蟹類生物中Wnt基因的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

EsWnt-4基因組織分布檢測所用中華絨螯蟹于2016年10月購自上海市浦東新區南匯果園市場，其中雌蟹個體體長為4.5 cm，體寬為4.8 cm，體質量為96 g；雄蟹個體體長為5.1 cm，體寬為5.2 cm，體質量為104 g。待其冰上冷凍麻醉后將其解剖，取其精巢、卵巢、肌肉、心臟、鰓、肝胰腺、胸腹神經團、腦、眼柄等組織，迅速置入液氮中冷凍，然后-80℃保存備用。

抱卵期的中華絨螯蟹由上海海洋大學吳旭干老師于2015年1月提供，并在解剖鏡下追蹤其受精卵的發育時期，分別采集受精卵、1細胞期、2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、囊胚期、原腸胚期、原溞狀體期等不同胚胎發育時期的樣品置于液氮中，并轉移至-80℃保存備用。

根據之前描述的中華絨螯蟹幼體發育時期的分期方式，在2016年4—6月份自啟東蟹苗養殖場采集中華絨螯蟹不同發育時期的幼體，包括第一溞狀幼體、第二溞狀幼體、第三溞狀幼體、第四溞狀幼體、第五溞狀幼體、大眼幼體，將其置于液氮中，并轉移至-80℃保存備用。將部分大眼幼體帶至實驗室進行養殖，待其發育到不同仔蟹時期時進行樣品采集，用于RNA提取。

1.2 樣品RNA的提取

根據Trizol試劑操作說明書提取所需樣品的總RNA，具體操作為：取250μL Trizol試劑迅速加入-80℃保存的樣品中，冰上充分勻漿后再加入750μL的 Trizol，劇烈震蕩15 s，冰上放置5 min；加入200μL氯仿，顛倒混勻，冰上放置3 min；12 000 r·min-1、4℃離心 15 min；取上清至新的離心管中，加入500μL異丙醇，混勻，靜置10 min；12 000 r·min-1、4℃離心 10 min；棄上清，加入1 mL75%乙醇，并用移液器吹打沉淀，然后75 000 r·min-1、4℃離心 5 min；小心的去除上清，待干燥后加入40μL無酶水；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，酶標儀測定其濃度。

1.3 EsWnt-4 cDNA序列篩選及驗證

對中華絨螯蟹卵巢轉錄組數據進行搜索，BLSAT及NJ聚類分析篩選出EsWnt-4基因的轉錄本序列（GenBank accession number：MH707438）。根據從轉錄組中獲得的轉錄本序列的 3′及 5′端序列設計引物 EsWnt-4F1（5′-GAGGAGGAGGGGGAGGAGG-3′） 和 EsWnt-4R1（5′-GACCGCAACCTTCCGACG-3′），對轉錄組數據進行驗證，并設計用于RT-PCR和熒光定量檢測 時 的 上 下 游 引 物 （EsWnt-4F2：5′-AAGCAATGCCCAGCTTCAGG-3′和 EsWnt-4R2：5′-GGAGCCGCTGTTGATGTCGT-3′）。

1.4 EsWnt-4 mRNA的組織分布檢測

分別取2μg各組織總RNA，用DNase去除樣品總 RNA中可能混有的基因組 DNA。使用Prime Script II 1st Strand c DNA Synthesis Kit合成c DNA第一條鏈，并以中華絨螯蟹β-actin基因的上下游引物（β-actinF：5′-CGACGGTCAGGTC ATCACC-3′和 β-actinF ：5′-ACGTCGCACTTC ATGATGGA-3′）進行 PCR擴增，檢測反轉錄效果。隨后以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2為上下游引物進行擴增，檢測EsWnt-4在中華絨螯蟹不同組織的表達情況。

1.5 EsWnt-4在胚胎及幼體時期的表達檢測

分別取中華絨螯蟹成熟的卵細胞、不同發育時期的胚胎及不同幼體時期樣品的總RNA 2μg，按照1.4操作步驟反轉錄獲得各樣品的cDNA。以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2為上下游引物，檢測EsWnt-4在中華絨螯蟹受精卵、胚胎期、幼體期和仔蟹時期的表達情況。β-actin基因的表達量作為內參，采用2-△△Ct法對基因的相對表達量進行分析，使用SPSS17.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 中華絨螯蟹Wnt cDNA序列特征

從中華絨螯蟹卵巢轉錄組數據庫中獲得一個被注釋為Wnt-4的RNA序列，長為1 027 bp，分析后發現其5′UTR為39 bp，3′UTR為155 bp，ORF為831 bp，其中在5′UTR處有一個核心堿基為“GGA”的微衛星片段（圖1）。另外，ORF編碼一個含277個氨基酸殘基的多肽，其等電點為8.97，蛋白分子量為29.37Kd。另外，BLAST檢測后發現該多肽含有一個WNT蛋白家族的保守區（圖1）。

2.2 序列比對及系統進化樹分析

利用 NCBI上 BLAST在線軟件對 EsWnt-4 ORF編碼的氨基酸序列進行分析，發現該多肽與節肢動物里絨蟲 （Euperipotaidei kanangrensis）的WNT-4在保守區的同源性高達98%，與其它脊椎動物如人、牛等物種的WNT-4也有97%的同源性。隨后，選取不同物種、不同亞族的WNT氨基酸進行聚類分析，結果顯示，中華絨螯蟹的WNT首先與絨蟲的WNT-4聚為一支，隨后再和其它脊椎動物的WNT-4聚為一支。而其它亞族各成員也以很高的置信度分別聚在一起（圖2）?；诖耍瑢⒃搶嶒灴寺〉玫降?WNT基因命名為EsWnt-4。

圖1 中華絨螯蟹Wnt基因cDNA序列及其編碼的多肽序列Fig 1 The cDNA sequence of EsWnt gene and the deduced amino acids sequence注：灰色陰影標注的為微衛星序列，黑線標注的為WNT蛋白家族的保守區Note：The SSR sequence was marked with gray shade，the conservative region of WNT protein was underlined

圖2 不同物種WNT氨基酸的系統進化樹Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of different WNT amino acids sequences

2.3 EsWnt-4在中華絨螯蟹各組織中的表達情況

RT-PCR檢測結果顯示，EsWnt-4在肌肉、肝胰腺、眼柄、鰓中不表達，在精巢、卵巢、胸腹神經團、心臟、腦中均有表達，但是表達量不同，其中在心臟、腦中的表達量最高，其次是精巢、卵巢，而在胸腹神經團中的表達量最低（圖3）。

圖3 EsWnt-4在成體中華絨螯蟹不同組織中的表達情況Fig.3 Expression of EsWnt-4 in different tissues of adult Eriocheir sinensis注：M：100bp DNA maker；Te：精巢；Ov：卵巢；Tg：胸腹神經團；He：心臟；Mu：肌肉；Hp：肝胰腺；Ey：眼柄；Br：腦；Gi：鰓Note：M：100bp DNA maker；Te：testis；Ov：ovary；Tg：thoracic ganglion；He： heart；Mu： muscle；Hp： hepatopancreas；Ey：eyestalk；Br：brain；Gi：gill

2.4 EsWnt-4在中華絨螯蟹胚胎發育過程中的表達量檢測

熒光定量PCR結果顯示，在成熟的卵母細胞及所檢測的各時期胚胎內，EsWnt-4都有表達。其中，成熟的卵母細胞中EsWnt-4含量較低，受精后其含量升高。在開始卵裂以后EsWnt-4含量下降，直到8細胞時期EsWnt-4含量均低于其在受精卵中的含量。在16細胞期EsWnt-4表達量驟增至最大，隨后其表達量又急劇下降，并在以后的胚胎發育期內均保持較低的表達量。

圖4 EsWnt-4在中華絨螯蟹成熟卵細胞及胚胎時期的表達情況Fig.4 Relative expression of EsWnt-4 in mature eggs and embryos in different developmental stages of Eriocheir sinensis注：a：成熟卵細胞；b：受精卵；c：2細胞；d：4細胞；e：8細胞；f：16細胞；g：囊胚；h：原腸胚；i：原溞狀體。*表示顯著性差異（P＜0.05）Note：a：mature eggs；b：fertilized eggs；c：2-cell stage；d：4-cell stage；e：8-cell stage；f：16-cell stage；g：blastocyst；h：gastrula；i：protozoea.*indicate significant differences statistically（P＜0.05）

2.5 EsWnt-4在中華絨螯蟹胚胎幼體及仔蟹中的表達量檢測

為了初步探索EsWnt-4基因在溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹等發育過程中的作用，筆者對第一至第五溞狀幼體階段、大眼幼體階段及一期和二期仔蟹時期樣品的RNA進行抽提，利用熒光定量PCR對EsWnt-4基因在這些時期內的表達量進行了測定。結果顯示，在溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹中EsWnt-4基因均有表達，但是在第一溞狀幼體、第三溞狀幼體、第四溞狀幼體、大眼幼體及仔蟹中EsWnt-4基因的表達量非常低，而在第二溞狀幼體及第五溞狀幼體時期EsWnt-4基因的表達量顯著高于其它時期，且第五溞狀幼體時期EsWnt-4基因表達量最高。

圖5 EsWnt-4在中華絨螯蟹不同幼體及仔蟹時期的表達情況Fig.5 Relative expression of EsWnt-4 in larvae and juvenile Eriocheir sinensis注：j：第一溞狀幼體；k：第二溞狀幼體；l：第三溞狀幼體；m：第四溞狀幼體；n：第五溞狀幼體；o：大眼幼體；p：第一仔蟹；q：第二仔蟹。*與**之間有顯著性差異（P＜0.05）Note：j：zoea-1larvae；k：zoea-2 larvae；l：zoea-3 larvae；m：zoea-4 larvae；n：zoea-5 larvae；o：megalopa；p：juvenile-1 crab；q：juvenile-2 crab.*and**indicate significant differences statistically（P＜0.05）

3 討論

Wnt-4在多種生命活動中具有重要的調控作用，如哺乳動物性別分化［6-7］，果蠅體節的形成和視網膜成像［1，15］，鳥類和魚類生物神經組織的發育［4，14］等。此 外，在 櫛 孔 扇 貝 （Chlamys farreri）［11］、厚殼貽貝（Mytilus coruscus）［12］等生物中，Wnt-4在不同的組織中都有表達，說明在這些物種中Wnt-4的功能并不單一。與此相同的是，中華絨螯蟹EsWnt-4基因在神經組織、心臟、性腺組織中均有表達，說明Wnt-4在中華絨螯蟹中也具有多種功能。

通常認為，在受精的過程中，精子僅將自身的遺傳物質及組蛋白攜帶至受精卵中。但近期研究發現，精子在受精時還會將一些調控因子或調控因子的mRNA攜帶至受精卵中［16-19］。如在小鼠中，Wnt-4的mRNA便可由精子攜帶至受精卵中，并且該轉錄本還可以在早期的胚胎發育時翻譯成蛋白，發揮功能［19］。在本實驗中發現，中華絨螯蟹成熟的卵細胞中EsWnt-4基因的表達量很低，受精后其表達量明顯上升，而在其后的2、4、8細胞期EsWnt-4的表達量又遠低于受精卵時期，因此筆者推測，中華絨螯蟹的精子也可以將EsWnt-4基因的轉錄本攜帶至受精卵中。此外，胚胎發育的早期，由精子和卵細胞繼承的基因處于沉寂狀態，需要等到一定的發育階段后才可以重新被激活并開始轉錄，完成受精卵的生命活動由母型調控向合子型調控的過渡［20］。不同種類物種胚胎基因被激活的時期各不相同。在果蠅、小鼠中來自親本的遺傳物質被重新激活是在2細胞期［21-23］；牛（Bos taurus）胚胎基因組的轉錄發生在 8細胞期［24］；綿羊（Ovis aries）胚胎中合子基因組啟動轉錄時間大約發生在16細胞期［25］。但是，最近有實驗證實，在一些生物中，受精卵的生命活動由母性調控向合子型調控過渡在精子與卵子染色體融合形成受精卵后就已經開始。因此，中華絨螯蟹受精卵中EsWnt-4 mRNA含量上升也有可能是受精卵自身基因被激活后轉錄所致。

在果蠅發育的早期，WNT4能夠調控體節的發育［1］，中華絨螯蟹EsWnt-4基因在第二溞狀幼體時期表達量迅速上升，而第二溞狀幼體發育為第三溞狀幼體時其腹節將會增加（由6節變為7節）［26］，說明EsWnt-4可能與中華絨螯蟹幼體發育時體節的形成有關。溞狀幼體變為大眼幼體后，中華絨螯蟹個體會發生非常明顯的形態學變化，包括頭胸甲的形成、螯足的出現［26］等。EsWnt-4在第五溞狀幼體時表達量達到最大，說明該基因在中華絨螯蟹由溞狀幼體變為大眼幼體的過程中具有非常重要的作用。