不同水生植物對大腸桿菌去除作用的比較研究

章 熙 鋒

(1.中國科學(xué)院 水利部 成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所，四川 成都 610041； 2.西南交通大學(xué) 地球科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，四川 成都 611756； 3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

美國環(huán)境保護署(USEPA)早在1990年就指出飲用水系統(tǒng)(尤其是地下水)的病原微生物(細菌、原生動物、病毒)污染已成為威脅人類身體健康最具挑戰(zhàn)性的問題之一[1]。污水中病原微生物是傳播疾病的主要媒介。以大腸桿菌為例，其致病物質(zhì)包括侵襲力、內(nèi)毒素和腸毒素，侵襲力則包含有抗原和定居因子等[2]，感染大腸桿菌易引起腹瀉、出血性大腸炎、腎衰竭和腦膜炎等疾病[3]。埃希氏大腸桿菌具有多個血清型，發(fā)病范圍較廣，嚴(yán)重影響人類健康發(fā)展[4]。據(jù)報道，由不衛(wèi)生水引發(fā)的疾病占全球疾病發(fā)病率的5.7%，占全世界死亡率的4%，其中大腸桿菌引起的疾病備受關(guān)注[5]。我國7億人飲用水源不合格，1.6億人飲用受有機物污染的水源，大腸桿菌超標(biāo)率達86%[6]。

由于污水源頭污染狀況加劇，農(nóng)村自然溝渠水體中可能存在大量病原微生物(包括腸道致病細菌、腸道病毒及噬菌體等)，其徑流可能造成下游人畜飲用水病原微生物污染超標(biāo)[7]。有關(guān)水體微生物指標(biāo)的研究表明我國各大水系均受到一定程度的微生物污染[8]。但目前針對自然水體病原微生物去除研究相對較少, 主要去除途徑為通過高溫滅菌、熏蒸等實驗室方法[9]。人工濕地與生態(tài)溝渠污水處理系統(tǒng)具有低投資、低能耗、低成本同時還具有美學(xué)價值，運行效果良好、維護管理方便、耐沖擊負荷強等優(yōu)點[10-11]。人工濕地也具有潛在的大腸桿菌污染去除能力，其中濕地水生植物的調(diào)控作用十分重要[12]。1949年Hasler和Jones首次發(fā)現(xiàn)水生植物能夠抑制微藻等微生物生長[13]。1984年Rice指出植物化感作用通過向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)對附近微生物產(chǎn)生直接或間接、促進或抑制作用[14]。同時許多研究已經(jīng)檢驗出植物組織可內(nèi)化人體病原體(例如：玉米、花生、三葉草、菠菜、香菜、萵苣和紅葉萵苣、芝麻菜、西紅柿、綠色洋蔥、小麥、大米、蘿卜芽、綠豆、蘿卜、卷心菜、大麥)[15-17]，Nicholson等也發(fā)現(xiàn)長葉萵苣能內(nèi)化腸出血性大腸桿菌O157: H7[18]。由于目前利用人工濕地與自然生態(tài)溝渠水生植物吸附去除大腸桿菌的技術(shù)研究較少，本研究擬篩選幾種適宜的水生植物作為人工濕地或生態(tài)溝渠的構(gòu)建物種，從而用于去除污水中大腸桿菌。本研究可為構(gòu)建農(nóng)村地區(qū)消除病原微生物(如大腸桿菌)污染的工程方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗條件材料及裝置

實驗所用生活污水樣于鹽亭縣林山鄉(xiāng)場鎮(zhèn)生活污水池采集。實驗所用土樣取自中國科學(xué)院鹽亭紫色土農(nóng)業(yè)生態(tài)實驗站(以下簡稱鹽亭站)實驗地旱地壤土，水生植物為實驗站內(nèi)生態(tài)溝渠和池塘內(nèi)本地適生植物(見圖1)。所需實驗儀器及裝置包括：100 mL滅菌取樣瓶、97孔定量檢測盤、程控定量封口機、紫外手持式紫外分析儀(西安立科環(huán)保科技有限公司)，并以直徑30 cm陶缽作為盆栽實驗培養(yǎng)器[19]。

圖1 水生植物Fig.1 Aquatic plants

1.2 實驗設(shè)計

室內(nèi)盆栽實驗于2017年4～5月進行，如圖2所示，采集同一塊試驗田旱地土壤，磨碎(<2 mm)后暴曬(減少土壤中原有微生物對實驗的影響)，將曬干土壤混合均勻并稱取27份(各2 kg)分別裝進27個不漏水的盆栽陶缽中，然后各加入5 L蒸餾水。選取8組水生植物(野茭白、狐尾藻、香菇草、蓮藕、美人蕉、水葫蘆、巖菖蒲、水芹、)進行合理密度移栽，另設(shè)置1組無水生植物作為對照，每組3個重復(fù)[19]。培養(yǎng)15 d后將各盆中水倒干，靜置1 d(促進根系微生物生長)。采集150 L含大腸桿菌的生活污水[19]，搖勻后以普通采樣瓶取50 mL水樣，分別用測定酸度計和電導(dǎo)率儀測定pH及電導(dǎo)率，同時以滅菌取樣瓶取100 mL污水樣，測定生活污水中大腸桿菌的初始濃度。初始數(shù)據(jù)測定完成后，向27個盆缽加入搖勻后的生活污水各5 L，保持室溫25℃繼續(xù)培養(yǎng)。

實驗初期大腸桿菌濃度變化較大，所以加入生活污水12 h后，進行第1次取樣檢測，此后取樣檢測周期改為48 h，每次取樣均同時測定各實驗處理的大腸桿菌(包括總大腸菌群和埃希氏大腸桿菌)、pH和電導(dǎo)率，共持續(xù)7個取樣周期，直至各實驗處理中大腸桿菌含量變化不明顯。考慮每周期取樣量和試驗處理盆中水分自然蒸發(fā)，每周期取樣后向各試驗處理盆中加200 mL蒸餾水，由于添加量較小，因此忽略由此引起的大腸桿菌濃度變化。

圖2 盆栽試驗步驟示意Fig.2 The procedure of pot experiment

溝渠實證實驗位于鹽亭站200 m長的實驗生態(tài)溝渠。在每場降雨事件發(fā)生后用100 mL滅菌取樣瓶分別采集源頭污水(主要來自場鎮(zhèn)生活污水)和經(jīng)過野茭白、再力花、香菇草、美人蕉、巖菖蒲、美人蕉、巖菖蒲、野茭白水生植物段的溝渠徑流，取樣點為沿水流路徑的0,1,2,3,4,5,6,7,8號點(見圖3)，同時用普通取樣瓶取50 mL徑流樣測定其pH及電導(dǎo)率[19]。生態(tài)溝渠水生植物基本指標(biāo)見表1。

圖3 生態(tài)溝渠植物配置與實景Fig.3 Configuration of ecological ditch plantation and the real scene

表1 生態(tài)溝渠水生植物基本指標(biāo)Tab.1 Aquatic plant index of ecological ditches

1.3 檢測方法與數(shù)據(jù)分析

本研究采用酶底物法測定水樣大腸桿菌(總大腸菌群和埃希氏大腸桿菌)含量[19-20]。用滅菌取樣瓶從各水生植物試驗處理盆中心位置取100 mL水樣稀釋到適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，加入ONPG和 MUG兩種營養(yǎng)指示劑，搖晃至完全溶解后均勻水平置入97孔定量檢測盤，利用程控定量封口機封口，將封口好的97孔定量檢測盤放入培養(yǎng)箱(37℃)培養(yǎng)24 h。總大腸菌群為97孔定量檢測盤大小孔變色個數(shù)計數(shù)；埃希氏大腸桿菌利用紫外燈下暗室中97孔定量檢測盤大小孔呈熒光個數(shù)進行計數(shù)，并通過查MPN表換算。

同時采集各實驗處理水樣50 mL，用雷磁PHS-3C+酸度計和便攜式BEC520電導(dǎo)率儀分別測定相應(yīng)實驗處理pH及電導(dǎo)率。

本實驗數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2007，運用origin 8.0作圖。采用SPSS軟件完成統(tǒng)計分析，方差分析基于LSD法，相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果分析

2.1 不同水生植物對大腸桿菌的去除率

由盆栽實驗結(jié)果(見圖4～5)發(fā)現(xiàn)：加入含大腸桿菌的生活污水后，不同處理盆缽中大腸桿菌含量發(fā)生了較為一致的變化，第1周期各試驗處理大腸桿菌(總大腸菌群和埃希氏大腸桿菌)含量出現(xiàn)劇增現(xiàn)象，從第2周期開始各實驗處理中大腸桿菌含量開始呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。第3周期后，美人蕉和巖菖蒲對大腸菌群的去除率分別高達95.99%，96.80%，顯著高于無水生植物的空白處理率(P<0.01)。上述結(jié)果表明在一定水力停留時間內(nèi)(4.5 d)，美人蕉、巖菖蒲去除總大腸菌群的效果更佳。對比其他水生植物處理實驗，香菇草、野茭白試驗處理對總大腸菌群的去除率僅為32.83%，67.60%，明顯偏低(P<0.05)，去除效果不佳。總體而言，水生植物美人蕉、巖菖蒲對總大腸菌群具有更加明顯的去除效果。

截至第3周期，水芹、狐尾藻、香菇草、巖菖蒲4中水生植物對埃希氏大腸桿菌的去除率分別高達99.13%，98.23%，97.78%，96.85%，蓮藕和無水生植物試驗處理對其去除率分別為76.60%、66.53%，去除效果明顯較差(P<0.05)。截至第7周期，各實驗處理對埃希氏大腸桿菌的去除率均達到較高水平。結(jié)果表明，各水生植物試驗處理對埃希氏大腸桿菌都具有一定的去除效果，其中水芹、狐尾藻、香菇草、巖菖蒲去除速度較快，效果最佳。

圖4 不同去除周期總大腸桿菌去除率動態(tài)Fig.4 Dynamic of total coliform removal rates in different cycles under different hydrophyte

圖5 不同去除周期埃希氏大腸桿菌去除率動態(tài)Fig.5 Dynamic of E. coli removal rates in different cycles under different hydrophyte

2.2 不同水生植物水環(huán)境變化特征

盆栽實驗結(jié)果表明：水生植物會不同程度地影響盆缽中生活污水的pH和電導(dǎo)率。由圖6可知，實驗開始時加入生活污水的初始pH值為8.24，從第2周期開始各水生植物處理組中生活污水pH值相對于空白對照處理均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，在第5周期狐尾藻和水葫蘆處理中生活污水pH值分別下降至7.41,7.51，顯著低于無水生植物空白對照處理(8.66)(P<0.05)。結(jié)果表明，水生植物能夠顯著降低水體pH。

圖6 盆栽實驗中不同周期pH動態(tài)Fig.6 pH dynamic in different cycles in the pot experiment

各處理盆缽中生活污水的電導(dǎo)率從實驗開始時的761.67 μs/cm下降到實驗結(jié)束時的600～760 μs/cm(見圖7)。結(jié)果表明，水生植物處理對電導(dǎo)率的影響并不顯著(P>0.05)。

圖7 盆栽實驗中不同周期電導(dǎo)率動態(tài)Fig.7 Electrical conductivity dynamic in different cycles in the pot experiment

2.3 生態(tài)溝渠不同植物段大腸桿菌原位去除率

與盆栽實驗結(jié)果一致，生態(tài)溝渠水體原位監(jiān)測結(jié)果顯示，污水經(jīng)過生態(tài)溝渠各植物段后大腸桿菌含量及pH均明顯下降，具體表現(xiàn)為總大腸菌群去除率為41.20%，埃希氏大腸桿菌去除率為78.58%，pH值由8.19降為7.52。各植物段大腸桿菌凈去除率如表2所示，再力花植物段對總大腸菌群去除率較高，美人蕉植物段對埃希氏大腸桿菌去除率較高，生活污水經(jīng)過香菇草植物段時總大腸桿菌含量呈現(xiàn)增加趨勢。大腸桿菌去除率與圖8中各折線斜率相關(guān)，折線斜率表示經(jīng)過該植物時相應(yīng)影響因子變化程度，從圖8中可以看出污水經(jīng)過再力花時總大腸菌群的適生因子大幅度惡化，污水流經(jīng)美人蕉植物組時埃希氏大腸桿菌的適生因子大幅惡化。

表2 生態(tài)溝渠不同植被段大腸桿菌去除率Tab.2 The removal rate of total coliform and E. coli in different sections in ecological ditch

注：TC為總大腸菌群；EC為埃希氏大腸桿菌。

圖8 生態(tài)溝渠不同植被段大腸桿菌去除率Fig.8 The removal rate of different vegetation sections in thecological ditch

3 討 論

3.1 不同水生植物大腸桿菌去除動態(tài)機理

Moore等研究表明病原微生物易吸附在比表面積大的土壤上[21-22]，同時植物存在對包括大腸桿菌在內(nèi)的病原微生物的內(nèi)化吸附去除作用[15-17]。其他研究也證明多種微生物可以通過植物細胞降解酶的作用，滲透到宿主植物的根部，在根皮層細胞中形成內(nèi)生菌根[23-25]；Gurtler等人[26]發(fā)現(xiàn)通過植物內(nèi)化作用，微生物能與多種病原菌形成共生關(guān)系，并且證明了韭菜根部能內(nèi)化大腸桿菌O157:H7。理論上實驗開始第1周期大腸桿菌含量應(yīng)急劇減少，但本實驗結(jié)果表明：從實驗開始向各處理中加入含大腸桿菌生活污水到實驗檢測第1周期，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)總大腸菌群和埃希氏大腸桿菌都呈現(xiàn)猛增現(xiàn)象(見圖4～5)，第2周期后各試驗處理大腸桿菌才呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。原因可能是因為盆缽?fù)寥乐泻写竽c桿菌及有利于其生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，污水加入后導(dǎo)致大腸桿菌呈現(xiàn)指數(shù)增長趨勢，繁殖速率遠大于土壤和水生植物對大腸桿菌的初始吸附去除速率。但伴隨著水生植物內(nèi)化吸附去除作用逐漸加強，以及土壤中維持大腸桿菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，大腸桿菌自然衰亡，從而使各試驗處理大腸桿菌的含量從實驗第2周期后呈現(xiàn)減少趨勢。

牟金明[27]研究發(fā)現(xiàn)，不同植物根系分泌物對微生物生存起到促進或者抑制作用。根系分泌物作用于根系周圍環(huán)境，根系分泌物使根際微生物數(shù)目和種類都有很大變化，使得根際微生物數(shù)量遠遠超過非根際。本研究中巖菖蒲為中草藥，其根系分泌物可能具有抑制大腸桿菌生長繁殖的成分，因此巖菖蒲大腸桿菌去除能力較強；本實驗研究還發(fā)現(xiàn)第2周期后，隨著維持大腸桿菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)消耗，無水生植物試驗處理大腸桿菌的含量也呈現(xiàn)下降趨勢，第5周期時總大腸菌群去除率達到93.56%，但香菇草和野茭白試驗處理去除率仍較低，僅為32.83%，67.60%。該現(xiàn)象可能是由于水生植物香菇草、野茭白根系分泌物有利于總大腸菌群的生長，從而導(dǎo)致其總大腸菌群含量超過無水生植物試驗處理。

羅中捷[28]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、鹽度、滲透壓以及pH等都是導(dǎo)致大腸桿菌進入VBNC(可生存但不可培養(yǎng))狀態(tài)的主要脅迫因子。李影等[29]研究發(fā)現(xiàn)pH對雞源大腸桿菌新陳代謝具有很大影響，水環(huán)境偏弱堿性有利于大腸桿菌的生存，而在冰醋酸(pH=2.0)誘導(dǎo)雞源大腸桿菌，7 d后菌液中可培養(yǎng)菌數(shù)即降為零。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)水生植物組相能顯著降低水體pH(見圖6)，因此本研究認為水生植物也可以通過改變水體pH進而影響大腸桿菌的生存繁殖能力。

3.2 水力學(xué)特征對生態(tài)溝渠大腸桿菌去除的影響

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)污水在生態(tài)溝渠水力停留時間(HRT)影響大腸桿菌去除率(見圖4～5)。盆栽實驗水生植物大腸桿菌去除率伴隨實驗周期的增加呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，經(jīng)過7個周期后大腸桿菌去除率高達95%以上，而經(jīng)過生態(tài)溝渠時，污水水力停留時間僅為2 h左右，水生植物不能充分吸附去除大腸桿菌，使得整個系統(tǒng)不同植被段大腸桿菌平均去除率較低，其中總大腸桿菌去除率約32%，埃希氏大腸桿菌約為55%。說明在生態(tài)溝渠凈化污水過程中，宜通過增加水力停留時間(如>5 d)提高病原微生物去除效率。

4 結(jié) 論

除香菇草、野茭白外，大部分水生植物具有較強大腸桿菌去除能力，美人蕉、巖菖蒲對總大腸菌群具有最佳去除效果。在構(gòu)建人工濕地和自然生態(tài)溝渠時，應(yīng)考慮選取具有高效去除大腸桿菌(總大腸菌群和埃希氏大腸桿菌)的當(dāng)?shù)剡m生水生植物及其組合，如巖菖蒲、狐尾藻、水葫蘆、美人蕉、再力花、水芹等，且人工濕地和生態(tài)溝渠水力停留時間應(yīng)設(shè)置為5 d以上。不同水生植物對大腸桿菌的去除效果和機理仍有待進行深入研究。