基于生物信息學方法預測野葛中的miRNA及其靶基因△

姚怡瑋，徐靜，楊萌，李燕呢，何美軍，郭坤元，吳斌*

1.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室/中國醫學科學院北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.北京市海淀區植物組織培養技術實驗室，北京 100091；3.湖北省農業科學院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000

野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi.為豆科Leguminosae葛屬Pueraria多年生木質藤本植物，是一種大宗重要中藥材，于2002年被國家衛生部認定為藥食兩用植物。野葛以其干燥根入藥，稱為葛根[1]，具有提高大腦記憶能力、改善和治療心腦血管疾病、抗腫瘤、保肝、消炎鎮痛等功效[2-3]，其主要生物活性成分為異黃酮類物質[4]。此外，野葛還富含淀粉、膳食纖維以及人體必需的多種氨基酸、礦物質和微量元素，在保健品開發方面具有不錯的市場前景。近些年大量研究者對于野葛的化學成分[5]、藥理作用[6]、代謝途徑解析及關鍵酶基因[7]方面進行了研究。

microRNA(miRNA)是一類由內源基因產生的、長度約為20～24 nt的非編碼RNA。在植物中，miRNA通常來自于含有莖-環結構的初級轉錄物(pre-miRNA)，接著在Dicer等一系列酶的作用下產生成熟的miRNA[8-9]。miRNA主要通過切割靶基因或者抑制其翻譯在轉錄后水平調節基因表達，從而在植物組織形態建成[10]、抗病[11]、非生物脅迫[11]、次生代謝產物合成[12]等方面起到了重要作用。然而迄今，在野葛上未見報道。

由于植物中miRNA在序列上具有高度保守性[13]，除了高通量測序結合計算機分析鑒定[14]，也可以利用生物信息學方法預測其保守miRNA[15]。即從miRBase下載已知的miRNA，將其與所研究的物種轉錄組數據比對，然后將比對上的轉錄本進行二級結構折疊，再根據miRNA的判定標準進行篩選，該方法被廣泛用于植物miRNA的鑒定[16-17]，在一些藥用植物，比如毛地黃[18]、甘草[19]、黃芪[20]中有過報道。本研究首次預測了野葛中保守miRNA及其靶基因，為今后解析miRNA在野葛防御反應、次生代謝產物合成等方面的作用奠定了基礎。

1 材料

于湖北省恩施州華中藥用植物園試驗基地采集2年生野葛P.lobata的根、莖和葉，凍于液氮中，然后保存在-80 ℃冰箱用于RNA的提取。

2 方法

2.1 已知植物miRNA序列的獲得

從miRBase(http：//www.mirbase.org/)中下載全部miRNA序列(版本22)，作為預測野葛中保守miRNA的參考序列。

2.2 野葛轉錄組數據及注釋文件的獲得

從GitHub(https：//github.com/rongchunhan/Pueraria_lobata/commits/master/Pueraria_lobata_contigs.fa)下載野葛的轉錄組序列和注釋信息，該序列是Han等測得[6]，由不同組織(葉、莖、幼嫩根、成熟根、根維管束)的測序數據混合拼接得來。

2.3 野葛miRNA的生物信息學預測

利用psRobot軟件[21]的前體預測模塊“psRobot-mir”，將上述miRNA序列與轉錄組拼接數據進行比對，采用默認參數，輸入文件格式均為fasta格式。psRobot內置mfold 3.5軟件(http：//www.bioinfo. rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)能夠預測并給出候選miRNA前體的二級結構和成熟的miRNA序列[22]。接著對候選的miRNA進行人工核實，參考Meyers等判定miRNA的標準[23]，略作修改，具體如下：1)預測的野葛miRNA前體能夠折疊成發夾狀的二級結構；2)成熟的miRNA與另一條臂上的互補序列不超過5個堿基的錯配；3)miRNA與另一條臂上的互補序列不超過3個bug；4)當兩條以上的miRNA序列同時比對上同一前體時，本研究以miRBase中大豆Glycinemax或者苜蓿Medicagotruncatula同家族miRNA的序列作為參照。

2.4 莖-環PCR驗證miRNA的真實性

用天根公司多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒(DP504)提取植物總RNA，具體操作參照說明書進行。提取野葛幼苗根的總RNA，并使用Nano DropTM2000分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度和完整性。

miRNA的檢測采用莖-環PCR法。隨機選取7條miRNA，分別設計反轉錄莖-環引物及PCR引物(見表1)，利用熒光定量PCR法驗證miRNA的真實性。

2.4.1 第一鏈反轉錄 首先配制無RNA混合物，將4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP、7.75 μL ddH2O、1 μL RT引物(1 μmol·L-1)在65 ℃放置5 min，接著迅速冰置2 min，接著添加4 μL 5x First-Strand緩沖液，2 μL 0.1 mol·L-1DTT，0.25 μL M-MLV(200單位/μL)，1 μL RNA模板，然后執行反轉錄程序：16 ℃ 30 min，60個循環的30 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，50 ℃ 1 s，75 ℃ 5 min，反轉錄產物作為熒光定量PCR的模板。

表1 miRNA反轉錄莖-環引物及PCR引物

2.4.2 熒光定量PCR 在PCR管中加入：10 μL 2x SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa，Japan)，1 μL通用反向引物(5 μmol·L-1)，1 μL miRNA特異的正向引物(5 μmol·L-1)，1 μL 上述反轉錄產物，7 μL H2O。使用Bio-Rad CFX96實時PCR系統C1000熱循環儀(Bio-Rad，USA)進行擴增。程序如下：94 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，45個循環94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 6 s。

2.5 野葛miRNA的靶基因預測

使用在線軟件psRNATarget[24]，采用默認參數對野葛miRNA的靶基因進行預測，通過罰分機制篩選潛在靶基因，規則為：U與G配對罰0.5分，其他不匹配罰1分；小于3個堿基插入或缺失罰2分，3個堿基及以上罰3分。為了保證靶基因的真實性，本研究選擇罰分≤3的結果作為miRNA的潛在靶基因。

3 結果與分析

3.1 野葛miRNA預測結果及其二級結構

使用psRobot軟件“psRobot-mir”模塊共篩選出27條候選miRNA前體，手工核實發現符合標準的共有25條，其中有9條前體產生2條miRNA，其余分別產生1條miRNA。最終在野葛中共預測出34條miRNA，它們屬于18個家族。這些miRNA的長度范圍為19～24 bp，見表2。

表2 野葛中預測的miRNA

續表2

注：*表示最小自由能折疊指數。

通常情況下，植物miRNA前體在長度和二級結構上存在多樣性[25]。在篩選過程中，筆者發現預測的野葛miRNA前體的長度變化相對較大，在90～203 bp；雖然其前體的長度和二級結構變化較大，但都能折疊成莖-環結構(見圖1)。

預測出的25條野葛miRNA前體的MFEI值范圍為0.64～1.20，平均為0.97(見表2)，其中大多數符合miRNA前體二級結構穩定性要求(MFEI大于0.8)[26]。

3.2 野葛miRNA真實性驗證

為了驗證預測的miRNA真實性，本研究隨機選取7條miRNA，通過莖-環實時熒光定量PCR進行實驗驗證。結果顯示這7條miRNA熒光定量PCR擴增產物的熔解曲線均為單峰。隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，均出現明顯單一條帶，大小約為60 bp(見圖2)，與預期莖-環PCR擴增的大小相一致，從而驗證這些miRNA的真實性。

圖1 部分野葛miRNA前體二級結構圖

注：M.50 bp DNA Maker(a.100 bp、b.50 bp)；1.miR156c-5p；2.miR166-5p；3.miR167-5p；4.miR168-3p；5.miR396b-5p；6.miR1507-3p；7.miR2089a/b-3p。圖2 miRNA莖-環引物PCR產物電泳圖

3.3 野葛miRNA靶基因預測結果及主要功能分析

根據預測出的34條野葛miRNA序列，通過在線psRNATarget軟件預測出235個靶基因，其中有66個有明確的功能，見表3。這些靶基因中有28個是抗病蛋白，其余則主要參與了野葛體內轉錄調節、信號轉導、物質運輸、防御反應等多種生物學過程。在這66個有明確功能的靶基因中，有的在不同科植物間高度保守，例如受miR156調控的SPL基因，其廣泛存在于許多科的植物中，是調控植物生長發育的重要轉錄因子[27]；miR162靶向DCL，在多科植物中有過報道，其能夠特異性地剪切雙鏈RNA并且自身也被miRNA靶向形成反饋調節[28-30]；還有的在同科植物中保守，例如本研究發現在豆科植物大豆和苜蓿中都找到miRNA1507靶向含有NBS的抗性蛋白[31-32]；其余的靶基因均為非保守。

表3 野葛中預測miRNA的靶基因及其編碼蛋白

續表3

續表3

4 討論

本研究在野葛中共鑒定出34條保守miRNA，預測出66個具有明確功能的靶基因，其中28個為抗病蛋白。在植物抗病防御中，具有核苷酸結合位點(NBS)的抗病基因被用于植物抗病基因識別和分類[33]。本研究預測到野葛的大部分抗病基因也包含這個特征。在野葛同科植物大豆中有報道miRNA負調控NBS抗病基因。在最近的研究中，哈達等在研究大豆花葉病毒病(SMV)時發現SMV可以通過誘導大豆中miR1507a、miR1507c、miR482a、miR168a和miR1515a的積累，下調NBS-LRR家族抗性基因來抑制大豆的防御反應。在抑制上述5個miRNA表達后，SMV在大豆中的感染率有明顯下降[32]。在野葛中，miR1507-3p被發現是與大豆miR1507a相同的保守miRNA，且其被預測的靶基因均為抗病相關基因。而在豆科植物苜蓿中，Zhai等[34]發現miRNA通過產生反式作用干擾小RAN(siRNA)負調控NB-LRR基因。這些結果為揭示野葛抗病的分子機制奠定了基礎。

還有研究表明，食物中的外源植物miRNA可以調節哺乳動物中靶基因的表達：在稻米中發現含量豐富的168a，被人食用后能夠減緩低密度脂蛋白從血漿中清除的速度，從而使食用者更易得高血脂、糖尿病等代謝疾病[35]。本研究在野葛中發現miR1514靶向Aladin蛋白質。目前已知編碼該蛋白的AAAS基因突變是導致三A綜合征的原因[36]。這一發現也暗示了miRNA可以跨界行使功能。

在世界范圍內，野葛主要分布于東亞及東南亞地區；在我國除青海、西藏等少數幾個省、自治區外，大部分省、自治區都有分布[37-38]。近年來隨著野葛需求量越來越大，現有的野生種質資源可能難以滿足日益增長的需求。解析野葛抗病的分子機制一方面有利于野葛栽培，提高其產量和品質；另一方面，野葛主要活性成分為異黃酮類、萜類、生物堿類等次生代謝產物。植物次生代謝及其調控是植物生長或進化過程中出現的對外界環境改變的適應，包括抵御一些環境脅迫和病蟲害。本研究預測得到的miRNA的靶基因中以抗病基因居多，關注野葛抗病基因為后續深入了解野葛miRNA的生物學功能，特別是在次生代謝中的作用奠定基礎。

本研究采用psRobot軟件進行了miRNA預測；以前采用BLAST或者soap程序將miRNA和轉錄組序列進行比對，然后將比對上的轉錄組序列用二級結構預測軟件進行折疊，再根據miRNA的標準進行篩選；相較于以前方法，本操作更加快捷、方便，psRobot內置二級結構折疊軟件mfold3.5在預測miRNA時可以同時輸出前體二級結構折疊和成熟的miRNA序列。

隨著高通量測序技術的發展，測序小RNA并結合生物信息學分析已經成為鑒定miRNA的主要手段。目前已經在紅豆杉[39]、人參[40]等藥用植物中得到應用。今后筆者將使用高通量測序野葛的小RNA數據，進一步預測其特異的miRNA和siRNA，并進行實驗驗證，使結果更加豐富可靠，為深入研究野葛中小RNA的功能奠定基礎。