生脈注射液UPLC特征指紋圖譜及11種成分定量分析△

柴瑞平，路娟，呂欣鍇，俞月，趙穎，陳曦

北京協和醫學院 中國醫學科學院 藥用植物研究所，北京 100193

生脈注射液是我國古代經典名方“生脈散”經現代工藝精制而成的中藥注射液，是中藥現代化的重要藥物之一。該藥由紅參、麥冬、五味子3味中藥材制得，臨床上常用于輔助治療膿毒癥、感染性或心源性休克及其他心腦血管類疾病[1-3]，療效確切，不良反應報道相對較少，使用量大，因此對生脈注射液進行全面質量控制顯得尤為重要，以期為臨床安全提供參考。

研究者多采用高效液相色譜法及液質聯用法(HPLC/UPLC-MS)對生脈注射液的特征成分進行分析，現有的指紋圖譜標定共有峰數量不多，多種成分分離效果不夠理想，尚未建立對3味中藥材不同成分同時測定的方法[4-7]。3味中藥材分別具有多種代表性活性成分，紅參中人參皂苷類成分在體內、體外均表現出良好的抗炎活性，可明顯抑制NO分泌，減少炎癥相關基因的mRNA表達，其機制可能與調控IRF3等通路有關；麥冬皂苷D可通過緩解內質網應激損傷從而對阿霉素致心肌損傷小鼠產生一定的保護作用；五味子醇甲具有一定的抗炎免疫作用[8-10]。多成分多靶點協同發揮藥效是中藥復方制劑的特色優勢，生脈注射液中多種成分具有抗炎抗氧化及逆轉組織損傷的藥理作用，因此對生脈注射液化學成分進行更全面地研究顯得尤為必要。

本研究采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法(UPLC-DAD)建立了生脈注射液全新的指紋圖譜方法，在35 min內分離數十種成分，同時找到了紅參、麥冬、五味子3味中藥的代表性成分，方法快捷簡單，穩定可靠，為進一步查找該藥藥效物質基礎提供了完整的實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀，配置四元高壓泵、自動進樣器、PDA檢測器；Mettler AB265-S電子分析天平；優普系列超純水機(成都超純科技有限公司)；SB25-12DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)

1.2 試藥

對照品人參皂苷Rb1(批號171018)、人參皂苷Rb2(批號171009)、人參皂苷Rd(批號170530)、人參皂苷Re(批號170924)、人參皂苷Rf(批號171126)、人參皂苷Rg1(批號180105)、麥冬皂苷D(批號171126)、五味子醇甲(批號180109)、五味子酯甲(批號171231)均購自上海融禾醫藥科技有限公司；人參皂苷Rb3(批號111686-201504)、人參皂苷Rg2(批號111779-200801)購于中國食品藥品檢定研究院，以上對照品純度均在98.0%～99.7%；乙腈、甲醇(色譜純，默克)；水(屈臣氏牌蒸餾水)。

生脈注射液共9批次，分別來源于5個不同的廠家，藥品信息見表1。

表1 不同批次生脈注射液藥品信息 mL/支

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱定人參皂苷Rb1對照品9.49 mg，人參皂苷Rb2對照品10.22 mg，人參皂苷Rb3對照品6.69 mg，人參皂苷Rd對照品6.24 mg，人參皂苷Re對照品6.24 mg，人參皂苷Rf對照品7.35 mg，人參皂苷Rg1對照品13.24 mg，人參皂苷Rg2對照品6.58 mg，麥冬皂苷D對照品5.12 mg，五味子醇甲對照品5.60 mg，五味子酯甲對照品3.27 mg，置于5 mL容量瓶中，加入一定量純甲醇，超聲至完全溶解，放置至室溫后定容，作為對照品儲備液待用。

分別精密吸取一定量對照品母液，置于5 mL容量瓶，定容、搖勻后，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取生脈注射液樣品輕輕搖勻后，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，編號同表1。

2.2 色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫程序見表2，流速為0.3 mL·min-1，全波長掃描(190～400 nm)，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。樣品及混合對照品色譜圖見圖1。

表2 定性定量色譜條件的流動相及比例

注：A.S1生脈注射液樣品；B.混合對照品；10.人參皂苷Rg1；11.人參皂苷Re；15.人參皂苷Rf；19.人參皂苷Rb1；20.人參皂苷Rg2；22.人參皂苷Rb2；23.人參皂苷Rb3；24.五味子醇甲；25.人參皂苷Rd；37.麥冬皂苷D；39.五味子酯甲。圖1 提取210 nm波長下生脈注射液UPLC圖

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取S1批次生脈注射液(批號：16120401005)的供試品樣品，連續進樣5次，色譜條件同2.2，記錄色譜圖，以五味子醇甲為參比峰，計算各共有峰相對峰面積的RSD均小于3%，相對保留時間的RSD均小于2%，表明該色譜儀精密度符合要求。

2.3.2 穩定性試驗 取S1批次生脈注射液(批號：16120401005)的供試品樣品，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，色譜條件同2.2，記錄色譜圖，以五味子醇甲為參比峰，計算各共有峰相對峰面積的RSD均小于3%，相對保留時間的RSD均小于2%，表明該色譜儀穩定性符合要求。

2.3.3重復性試驗 取批號為16120401005的生脈注射液供試品樣品，共6份，進樣條件不變，記錄色譜圖，以五味子醇甲為參比峰，計算各共有峰相對峰面積的RSD均小于3%，相對保留時間的RSD均小于1%，表明該色譜儀重復性符合要求。

2.3.4 參照峰選擇與共有峰標定 在9批次生脈注射液供試品指紋圖譜中，五味子醇甲色譜峰分離度較好，峰面積較大且穩定，保留時間合適，故確定24號五味子醇甲色譜峰為參照峰。

將9批次生脈注射液UPLC指紋圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2004A版進行色譜峰匹配，經處理后共標定44個共有峰，并確定11個共有峰，分別為人參皂苷Rg1(10號峰)、人參皂苷Re(11號峰)、人參皂苷Rf(15號峰)、人參皂苷Rb1(19號峰)、人參皂苷Rg2(20號峰)、人參皂苷Rb2(22號峰)、人參皂苷Rb3(23號峰)、五味子醇甲(24號，S)、人參皂苷Rd(25號峰)、麥冬皂苷D(37號峰)、五味子酯甲(39號峰)，見圖2～3。

圖2 9批次生脈注射液UPLC指紋圖譜

圖3 指紋圖譜對照圖譜

2.3.5 相似度評價 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2004A版軟件計算分析，9批生脈注射液供試品色譜圖中色譜圖相似度均>0.91，具體數據見表3，表明批次間差異較小，制備工藝較為穩定，方法準確可靠。

2.4 生脈注射液多指標成分定量分析

2.4.1 線性關系考察 精密吸取各對照品儲備溶液配制混合對照品溶液，將混合對照品溶液按比例稀釋成一系列梯度濃度的混合對照品溶液，按2.2項色譜條件進樣測定，記錄液相色譜圖。以各成分色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，進樣濃度(X)為橫坐標，制作標準曲線，回歸方程等見表5。

表3 不同批次生脈注射液相似度比較

表5 生脈注射液指標成分回歸方程、峰面積與濃度相關系數(r)及線性范圍

2.4.2 精密度試驗 取同一對照品溶液，連續進樣6次，進樣條件不變，記錄色譜圖，測定峰面積，計算11種成分的精密度。結果RSD為0.20%～1.11%，表明該色譜儀精密度良好，符合含量測定要求。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批生脈注射液(批號：16120401005)的供試品樣品，分別于0、2、4、6、8、12、20、24 h進樣，進樣條件不變，記錄色譜圖，測定峰面積，計算結果RSD為0.53%～1.34%，表明樣品溶液于24 h穩定性良好，符合含量測定要求。

2.4.4 重復性試驗 取同一批生脈注射液(批號：16120401005)的供試品樣品，共6份，平行制備供試品溶液，進樣條件不變，記錄色譜圖，測定峰面積。結果RSD 為0.59%～1.45%，表明該色譜儀重復性良好，符合含量測定要求。

2.4.5 加樣回收率試驗 取同一批生脈注射液(批號：16120401005)的供試品樣品，共6份，每份取2.5 mL于5 mL容量瓶中，加入混合對照品溶液適量，加純水至刻度后制得供試品溶液，進樣條件不變，記錄峰面積及色譜圖。結果人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、麥冬皂苷D、五味子醇甲、五味子酯甲平均回收率分別為105.25%、99.83%、110.06%、109.43%、98.02%、104.41%、97.89%、111.20%、98.76%、102.76%、108.91%，RSD值分別為3.11%、2.56%、1.89%、2.49%、2.71%、3.04%、2.12%、1.56%、1.91%、2.06%、2.00%，表明本方法準確可靠，符合含量測定要求。

2.4.6 含量測定 取9批次生脈注射液，按2.2項色譜條件進行測定，分別在各成分最大吸收波長處提取峰面積進行計算，測得樣品中11種成分的含量，結果見表6。9批次樣品的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、麥冬皂苷D、五味子醇甲、五味子酯甲的含量分別為56.99～101.69、20.63～44.63、2.79～5.05、13.99～30.09、41.52～62.10、8.24～16.94、80.00～88.99、4.14～9.69、1.28～3.42、29.05～73.09、2.61～4.85 μg·mL-1。

3 討論

3.1 指紋圖譜提取波長的選擇

本研究中采用全波長掃描(190～400 nm)，綜合考慮人參皂苷類成分、麥冬皂苷D、五味子醇甲、五味子酯甲最大吸收波長分別為：203、208、210、216 nm，最終選擇210 nm作為指紋圖譜的提取波長，此波長下各成分峰形良好，基線平穩，符合指紋圖譜相關要求[11-13]。

3.2 色譜條件的優化

在流動相種類與比例優化過程中，本研究先后考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水系統，結果以乙腈-水為流動相的條件下，實驗得到的色譜峰數量較多，分離度較佳，經梯度洗脫可將絕大多數成分成功分離，控制洗脫時間于35 min，對于中藥復方制劑來說，因成分種類復雜，該時長相對合理快速；柱溫對色譜峰分離存在一定影響，本研究通過考察25、30、40 ℃，發現40 ℃條件下，各峰分離度為最佳，不會出現峰包裹的情況[14]。

表6 各成分含量測定結果(n=3) μg·mL-1

3.3 樣品測定結果分析

結合UPLC指紋圖譜與多成分含量同時測定的方法，本研究發現，不同廠家9批次生脈注射液質量一致性較好，總體差異較小，說明生脈注射液的制備工藝穩定，質量可控性良好。其中一個廠家的生脈注射液的五味子醇甲含量高于其他廠家的產品，可能與藥材采收的地點、時間等因素有關[14]，因此同一廠家多批次藥品進行質量一致性評價也顯得尤為重要[15]。故提升生脈注射液質量標準，首先要優化現行色譜條件，五味子醇甲等成分也應考慮作為質量評價指標之一，含量限度則應綜合不同品牌液相的方法耐用性考察及高分辨質譜的測定結果共同制定。

4 總結

本研究利用UPLC法，在同一色譜條件下，建立了生脈注射液指紋圖譜，系統判定的44個共有峰，整體反映了其化學成分特征，同時在35 min測定了人參皂苷Rb1等11種活性成分的含量，將模糊鑒別與精準定量分析相結合，能系統快速地對生脈注射液進行質量評價。中藥注射液安全使用問題自該劑型面世以來備受關注，對中藥注射液化學概貌研究不僅可以用于評價不同企業的藥品生產工藝是否穩定可控，還對臨床使用具有十分重要的警示作用，避免對某種中藥甚至某種成分存在不良反應史的患者使用，降低臨床風險，為“中醫藥精準醫療”提供合理思考[16]。