四妙勇安湯對ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠IL-6和MCP-1的影響△

宋珂，侯彥宏，蘇都娜，楊會，白云綺，李慧，婁利霞，趙一舟，吳愛明，圖雅，聶波*

1.北京中醫藥大學 東直門醫院 中醫內科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700；2.中國中醫科學院 中醫藥發展研究中心，北京 100700；3.內蒙古赤峰市安定醫院，內蒙古 赤峰 024000；4.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029

《中國心血管病報告2017》發布心腦血管疾病目前仍然是人類死亡的首要原因，而動脈粥樣硬化(arterosclerosis，AS)是作為其發生發展的最重要的病理基礎。AS被認為是一種慢性炎癥性的脂類在血管內皮下沉積的代謝疾病[1]，病因病機尚未完全明確，而炎癥反應貫穿于AS起始、進展及斑塊破裂血栓形成的全過程，是斑塊不穩定發生破裂的中心環節[2]。其中炎性細胞因子在AS的發生發展中的互相作用也成為AS研究中的一個新領域。

鑒于AS炎癥反應與中醫毒邪致病特點的相似之處，本課題在既往的中醫痰瘀病機基礎上，提出從毒論治理念，采用具有解毒活血作用的四妙勇安湯干預AS病變。目前，四妙勇安湯在AS相關疾病的臨床應用日益廣泛。王立茹[3]認為在明確有頸動脈粥樣硬化的患者長期加服適量加味四妙勇安湯可能有助于減輕頸動脈粥樣硬化的進展，穩定斑塊從而減輕腦梗死的發病率。還有以四妙勇安湯為主方加減，治療血栓閉塞性脈管炎、動脈硬化性閉塞癥、下肢深靜脈血栓、雷諾氏病、糖尿病周圍血管神經病變等周圍血管性疾病均能取得滿意的療效[4-5]。

既往研究工作從動物及細胞水平均證實四妙勇安湯干預AS有效，對相關炎性因子具有調節作用[6-7]。本研究采用經典的“西方膳食”[8]誘導ApoE-/-小鼠構建動脈粥樣硬化疾病模型，觀察四妙勇安湯對小鼠主動脈的病理改變，以及白介素-6(IL-6)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)炎癥因子的影響，進一步研究四妙勇安湯防治AS斑塊療效及可能的抗炎作用機制，為臨床中對AS疾病的中醫治療開拓多途徑、多靶點的用藥思路。

1 材料

1.1 動物和飼料

C57BL/6小鼠，雄性，7周齡，體質量18～20 g，SPF級；ApoE-/-小鼠，雄性，7周齡，體質量18～20 g，SPF級；小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001。室溫保持22～24 ℃，相對濕度50%，12 h交替照明，飲水不限，自由攝食。本研究獲得北京中醫藥大學東直門醫院動物倫理委員會的批準下進行[編號：京中東內(2016)06號]。高脂飼料配方為21%脂肪+0.15%膽固醇+78.85%基礎飼料，均購自北京科澳協力飼料有限公司，許可證號為：SCXK(京)2014-0010，飼料均經60Co γ照射滅菌處理。

1.2 藥物及試劑

阿托伐他汀鈣片(立普妥，輝瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20051408，產品批號：N37492)；四妙勇安組方：金銀花(批號：15051904)90 g、當歸(批號：150313061)60 g、玄參(批號：150181431)90 g、甘草(批號：150280731)30 g，購于北京中醫藥大學東直門醫院藥房，由本實驗室水煎濃縮制備，分裝4 ℃保存；RnD多因子檢測試劑盒，貨號：LXSAMSM-09，批號：L122950。

1.3 儀器

OLYMPUS BX60光學顯微鏡(日本Olympus公司)，HANGPING JA 1003N精準天平(上海儀器儀表廠)，XTT型000037體視鏡(上海勤奮儀器廠)，AU5800全自動生化測定儀(美國BECKMAN COULTER 公司)，Centrifuge 5424R低溫多用途離心機(德國eppendorf公司)，X-200Luminex液態芯片(澳大利亞Luminex)。

2 方法

2.1 動物模型建立、分組與給藥

所有動物適應性喂養1周后，C57BL/6J為正常對照組，給予基礎飼料，Apo E-/-小鼠給予高脂飼料喂飼14周后，隨機抽取10只，檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，取主動脈行HE染色，觀察AS模型形成情況。確定成模后將剩余ApoE-/-小鼠隨機分為5組，分別為模型組，陽性藥阿托伐他汀組，四妙勇安湯高、中、低劑量組，每組10只。四妙勇安湯高、中、低劑量組及陽性藥組均依照“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”計算各組臨床等效劑量換算，分別按照34.9、23.14、11.68、2.57 g·kg-1灌胃給藥。除對照組之外，其余各組均繼續高脂喂養，對照組和模型組給予等劑量的去離子水，每日1次，連續給藥12周。

2.2 血清學指標

給藥12周后進行取材，取材前夜禁食不禁水，摘除眼球取血，將其麻醉過量致死，2500 r·min-1，4 ℃離心20 min，分離血清，應用全自動生化分析儀檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C含量。

2.3 病理組織學分析

取血后，取其小鼠主動脈根部，置于4%多聚甲醛中固定，手動輪轉式切片機連續切片，厚度3 μm，進行HE染色。在100倍光鏡下對組織切片隨機選擇3個視野進行觀察并采集圖像，用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件進行圖像分析。測量指標為內膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)、血管管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)，其中IT、PA、IT/MT及PA/LA取其均值入統計學分析。見圖1。

注：IT=[(內彈力板周長/π-殘腔周長/π)/2]；MT=[(外彈力板周長/π-內彈力板周長/π)/2]；LA=內彈力板圍繞面積；PA=內彈力板圍繞面積-殘腔面積；內中膜比值=IT/MT；主動脈狹窄率=PA/LA×100%。圖1 主動脈PA、IT、PA/LA、IT/MT具體測量方法

2.4 血清細胞因子檢測

取血后，4 ℃離心，分離血清后，采用Luminex液態芯片檢測技術，嚴格按照X-200Luminex操作方法操作，檢測血清中IL-6和MCP-1炎癥細胞因子的表達情況。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 各組小鼠對血脂的影響

高脂喂養14周后，經血脂檢測及HE染色后確定模型建立，繼續給藥12周后，進行血脂檢測，結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C明顯提高(P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組及四妙勇安湯高、中、低劑量組TC、TG、LDL-C及HDL-C無明顯的變化，差異無統計學意義(P>0.05)(見圖2)。

3.2 各組小鼠對主動脈根部病理形態的影響

HE染色顯示：對照組小鼠主動脈內膜完整，內皮細胞及平滑肌細胞排列整齊規則，無AS斑塊形成。與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈根部內膜明顯增厚(P<0.01)，中膜平滑肌排列紊亂且萎縮變薄，內中膜厚度比值明顯增大(P<0.01)；主動脈斑塊內可見大量泡沫細胞和膽固醇結晶沉積，斑塊面積明顯增大(P<0.01)，斑塊與管腔面積比明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組主動脈根部內膜比較完整，厚度較模型組明顯減少(P<0.01)，中膜平滑肌排列規則，內中膜厚度比值明顯減小(P<0.01)；主動脈內膜局部僅有少量泡沫細胞的形成，斑塊面積明顯減小(P<0.01)，僅四妙勇安湯高劑量組的斑塊與管腔面積比明顯降低(P<0.01)，其余各給藥組差異無統計學意義(P>0.05)，各給藥組的病變程度明顯輕于模型組，但四妙勇安湯高、中、低各組與陽性藥組的差異無統計學意義。見圖3、4。

3.3 各組小鼠對MCP-1及IL-6的影響

與對照組比較，模型組IL-6明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.01)，同時四妙勇安湯各劑量組IL-6的表達均明顯下降(P<0.01)，尤以四妙勇安湯中劑量組更為明顯(見圖5)。

與對照組比較，模型組MCP-1明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥組MCP-1明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，同時四妙勇安湯高劑量組及低劑量組明顯下降(P<0.01)，四妙勇安湯中劑量組明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖5)。

注：A.TC；B.TG；C.HDL-C；D.LDL-C；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖2 各組ApoE-/-小鼠對血脂的影響

注：A.對照組；B.模型組；C.陽性藥組；D.四妙高劑量組；E.四妙中劑量組；F.四妙低劑量組。圖3 各組小鼠主動脈的病理形態影響(蘇木素伊紅染色，100×)

注：A.內膜厚度；B.斑塊面積；C.管腔狹窄率；D.內中膜厚度比。圖4 各組小鼠對主動脈PA、IT、PA/LA、IT/MT比較

注：A.IL-6；B.MCP-1。圖5 各組小鼠血清IL-6和MCP-1的比較

4 討論

本研究采用西方飲食高脂飼料配方飼養ApoE-/-小鼠，因未予外界物理損傷干預，充分模擬了正常人的AS過程，是評價AS的經典的造模方法，而且這種高脂血癥小鼠的脂紋病變及廣泛的纖維斑塊損傷，與人類AS病變的發生、發展過程及病變部位均十分相似，目前已成為探討高血脂癥及其所致AS發生、發展機制及研究干預手段的極佳動物模型。越來越多的研究表明，他汀類藥物通過它們的多效性，如通過改善內皮功能障礙、穩定斑塊、抗炎作用等發揮抑制AS作用[9-10]，但有研究報道顯示他汀類藥物不具有降低ApoE-/-小鼠的膽固醇作用，與其缺乏合成膽固醇的LDLr和LDLr相關蛋白的臨界配體(ApoE)有關[11]。在類似的實驗條件下，Sparrow等均證實以上觀點[12-13]。本研究結果與其一致，他汀類藥物不具有降低ApoE-/-小鼠血脂作用。

在AS發生和發展過程中，動脈內膜是炎癥反應最早累及的部位，尤其是大中型動脈內膜。內膜增厚是AS的早期征象，反映動脈血管對脂質浸潤和炎癥的反應。主動脈是AS最常見、最易累及的大血管之一，PA、IT、PA/LA、IT/MT是診斷AS的早期指征，是心腦血管疾病重要的危險因素與預測因子。本研究中主動脈HE染色觀察到模型組有典型粥樣斑塊形成、內膜明顯增厚、斑塊內大量脂質沉積及炎性細胞浸潤，而四妙勇安湯干預后很好地改善這一現象，局部僅有少量泡沫細胞的形成，AS斑塊面積明顯減小，病變程度明顯輕于模型組。與模型組比較，四妙勇安湯高中低劑量組的PA、IT及IT/MT明顯降低，具有統計學差異，進一步研究明確四妙勇安湯能夠降低斑塊面積、減少內膜厚度、有效減輕AS的病變程度。

Tzoulaki等[14]報道，IL-6是AS進程中的炎癥標志物，同時也是心血管疾病的獨立危險因素。IL-6能夠將急性炎性反應放大，促進慢性炎癥反應的產生，是炎癥反應的一個中樞性調節因子[15]。MCP-1是被確認的具有趨化及活化單核/巨噬細胞的重要趨化細胞因子之一[16]。在AS病變后期，MCP-1能夠使斑塊趨向不穩定，導致斑塊破裂[17]。最新的研究報道顯示，AS斑塊中MCP-1的豐度可能表明它在AS的起始、形成和發展中起著至關重要的作用[18]，是加速AS形成的獨立危險因素之一[19]。相關研究表明，IL-6可以使巨噬細胞分泌MCP-1，使單核細胞聚集進入血管內皮下，參與形成粥樣硬化斑塊[20]；MCP-1能活化白細胞并介導其產生炎性介質，如IL-6等，持續過度的IL-6產生破壞細胞因子網絡，促進血管內皮細胞表達ICAM1和VCAM1，并促進內皮細胞分泌趨化因子如MCP-1，進而趨化IL-6本身[21]，使得心血管疾病發生率更進一步提高。

本研究結果顯示，與模型組相比，四妙勇安湯高、中、低劑量組血清中IL-6和MCP-1水平明顯低于模型組，具有統計學差異(P<0.01、P<0.05)，說明四妙勇安湯能夠有效降低ApoE-/-小鼠AS模型的IL-6和MCP-1的表達，從而抑制炎癥穩定AS斑塊的作用。

本方以玄參、金銀花滋陰清熱解毒為君，當歸養血活血、化瘀散結為佐，甘草調和諸藥為使，系清養結合、瘀毒并驅、標本兼治、共助滋陰解毒活血之法，是解毒活血的代表方。現代藥理學研究顯示，四妙勇安湯中含有綠原酸、甘草苷、木犀草素等化學成分，具有顯著的抗菌消炎、抗氧化、清除自由基、降脂、免疫調節等作用[22-23]，這些藥物成分是四妙勇安湯發揮抑制炎癥、穩定斑塊的主要物質基礎。因此，四妙勇安湯發揮抗AS作用與炎癥機制關系密切。

本實驗研究以ApoE-/-小鼠為研究對象，采用經典西方膳食構建AS模型，并使用解毒活血法的代表方四妙勇安湯進行早期干預，結果表明，四妙勇安湯可以通過抑制炎性因子IL-6和MCP-1表達，進而抑制AS的炎癥反應、降低內膜厚度、減少斑塊面積等，從而發揮抑制炎癥反應、穩定斑塊的藥理作用，然而其具體的抗炎分子機制有待于更深層次的研究。