雅連和云連中生物堿的含量測定△

吳佳，匡艷輝

1.長沙民政職業技術學院醫學院，湖南 長沙 410004；2.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515

黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。以上三種分別習稱“味連”、“雅連”和“云連”。主要分布于我國重慶、湖北、四川、云南等地。其味苦，性寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經。具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效[1-2]。

味連、雅連和云連受到政策指導、市場價格、每畝產量等多方面因素的影響，分布呈極端情況。據實際調查和樣品收集，目前味連在市場上占絕對主導地位，而雅連和云連在市場上基本沒有發現。2015版《中華人民共和國藥典》一部中只有味連的含量測定項，卻沒有雅連和云連的含量測定項。通過大量文獻調研發現，雅連和云連中生物堿的質量控制方法多為紫外分光光度法或薄層色譜法[3]。雅連和云連同為黃連的重要品種，為了黃連藥用資源的可持續發展，本研究擬收集雅連和云連樣品，采用HPLC法制定雅連和云連的質量標準。

有文獻檢測了不同產地和品種黃連藥材中的總生物堿，發現不同基原的黃連中總生物堿的含量有差異[4]；有研究檢測了不同產地和品種黃連中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和藥根堿的含量，也發現不同基原的黃連中這幾種生物堿的含量有差異[5]。我們總共收集到了5批雅連藥材和10批云連藥材，對上述黃連藥材進行了含量測定，為雅連和云連的質量標準的制定提供指導依據。

1 方法學的建立

1.1 混合對照品溶液的制備

精密分別稱取5個生物堿：鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿4.39、2.59、2.39、4.90、28.78 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得各對照品溶液；分別精密量取各對照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即為混合對照溶液，4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 供試品溶液的制備

取雅連或云連藥材粉末(40目)約0.2 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)溶液50 mL，稱重，超聲30 min，冷卻，加甲醇補足重量，濾過，取續濾液過0.45 μm濾膜，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5 C18(250×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基磺酸鈉0.4 g，再以磷酸調節pH值為3.0)為流動相；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL·min-1；檢測波長：345 nm；進樣體積：10 μL。在上述色譜條件下，雅連藥材和云連藥材HPLC色譜圖如圖2及圖3所示，色譜圖顯示雅連含有表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿4個生物堿，而云連則只含有黃連堿、巴馬汀和小檗堿3個生物堿。上述色譜條件下，對照品藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿5個生物堿分離良好。如圖1。

注：1.藥根堿；2.表小檗堿；3.黃連堿；4.巴馬汀；5.小檗堿。圖1 混合對照品HPLC色譜圖

注：2.表小檗堿；3.黃連堿；4.巴馬汀；5.小檗堿。圖2 雅連樣品HPLC色譜圖

注：3.黃連堿；4.巴馬汀；5.小檗堿。圖3 云連樣品HPLC色譜圖

1.4 線性范圍

依次將1.1所述混合對照品溶液稀釋5、10、20、25、50、100、200倍，各進樣10 μL分析，每個體積進樣2次，取峰面積積分值的平均值，見表1。以進樣量對峰面積積分值進行線性回歸處理，得藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的回歸直線方程，見表1。

表1 五個生物堿的標準曲線

1.5 精密度試驗

依次將1.1所述混合對照品溶液，連續進樣5次，每次10 μL，記錄藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的峰面積，得出日內精密度見表2。

表2 五個生物堿的精密度

1.6 穩定性試驗

取云連供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h進樣，每次10 μL，記錄黃連堿、巴馬汀和小檗堿的峰面積，見表3。表明處理后的樣品在2 d內穩定。

表3 云連穩定性試驗結果

1.7 重復性試驗

精密稱取云連藥材粉末共6份，按1.2項下制備樣品，測得黃連堿、巴馬汀和小檗堿的平均含量和RSD分別見表4。

表4 云連重復性試驗結果 %

1.8 加樣回收率

精密稱取云連藥材粉末約0.1 g共6份，加入適量對照品，按1.2項下制備樣品進行HPLC測定，計算加樣回收率。黃連堿、巴馬汀和小檗堿的平均回收率及RSD見表5。

表5 云連加樣回收率試驗結果

2 樣品測定

按正文含量測定方法，取5批雅連藥材和10批云連藥材依法測定，結果如下，見表6及表7。

表6 雅連樣品中4個生物堿含量測定結果 %

表7 云連樣品中3個生物堿含量測定結果 %

3 討論

黃連的三種不同基原中，味連在市場上占絕對主導地位，以重慶石柱為道地產區。這是由于20世紀50年代，國家大力扶持中藥材種植，四川、陜西、湖南等地開始從重慶石柱引種，之后也形成了穩定的種植規模，湖北利川、恩施等地也擴大了種植規模[4]。雅連傳統以四川峨嵋、洪雅、夾江、雅安等地為道地主產區。但自50年代起從重慶引種味連后，雅連種植逐漸萎縮[5]。經實地調查，目前已幾乎沒有種植生產，其原因在于雅連為“單枝連”，畝(1畝≈666.7 m2)產僅在80～120 kg，而味連畝產在300 kg左右，市場價格無差異、種植年限均為5年，所以藥農不愿意種雅連。云連僅產于云南局部地區，也為單枝連，畝產略高于雅連。據本研究中的實地調查，目前僅在云南福貢和鄰近的貢山一帶有種植，近3年種植規模逐漸擴大到接近1萬畝，一般4年收獲。由于近3年才開始規模化種植，年限不到，所以現在市場上幾乎沒云連商品藥材。

味連，雅連和云連三種黃連中的生物堿的種類有所不同，通過HPLC圖可以看出，雅連中含有表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿4個生物堿，至于是否含有藥根堿還有待繼續研究。而云連中則含有黃連堿、巴馬汀和小檗堿3個生物堿，所收集的樣品中暫時沒有檢測到藥根堿和表小檗堿。而潘正等[6-7]同時測定云連藥材中6種生物堿的結果發現，云連藥材中6種生物堿的平均含量差異較大，其中鹽酸小檗堿最高，表小檗堿含量最低，甚至有些批次沒有檢測到，間接證明了云連中表小檗堿的含量較低，甚至難以檢測出來。而該研究中檢測出了藥根堿，導致這樣的結果差異可能與收集的藥材產地有一定的關系。

崔燦[8]對四川、湖北、重慶、陜西和云南等產地所產的黃連中生物堿含量的測定結果顯示，不同產地黃連的各種生物堿含量和總生物堿含量有明顯差異，表明黃連的生物堿含量與黃連生長環境有密切關系。這再次證明了味連、雅連和云連中生物堿種類存在差異。

本文首次對雅連和云連中的生物堿種類進行比較，并利用其種類的差異為區分黃連品種提供依據，而化學成分方面的差異是否會導致藥理藥效方面的差異則有待進一步的研究。