簡(jiǎn)化樣品處理快速測(cè)定酸棗仁中多種成分含量的研究△

周賽男，郭寶林

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001

酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥種子，別名棗仁，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝，寧心安神等功效，也是藥食同源物質(zhì)，主要用于改善睡眠。酸棗仁主要含有皂苷類和黃酮類化學(xué)成分，2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]規(guī)定酸棗仁含量測(cè)定成分為皂苷類的酸棗仁皂苷A(jujuboside A)和黃酮類的斯皮諾素(spinosin)，在供試品溶液制備過(guò)程中，需要先用石油醚索氏提取4 h去掉油脂，然后加熱回流提取2 h，該方法也被大多數(shù)含量測(cè)定文獻(xiàn)采納[2-10]，但該方法較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。

含有油脂的種子類藥材的成分分析，先脫脂后提取是傳統(tǒng)方法，傳統(tǒng)認(rèn)為脂肪含量高時(shí)，可能影響目標(biāo)成分的完全提取，且如果不脫脂，提取液中含有的脂肪可能會(huì)影響液相色譜柱的柱效。但經(jīng)查閱2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中富含油脂類種子藥材共有47種，僅有13種采用了先脫脂后提取的工藝，表明該方法不是普遍方法，更值得關(guān)注的是，同樣測(cè)苦杏仁苷含量的桃仁和杏仁兩個(gè)藥材，樣品前處理桃仁是先石油醚加熱回流1 h脫脂，后70%甲醇加熱回流1 h提取，而苦杏仁則直接用甲醇超聲處理30 min，說(shuō)明脫脂過(guò)程可能是非必須的。本研究組一直從事酸棗仁的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和品種優(yōu)選工作，為滿足大量的樣品快速測(cè)定，建立了一種不脫脂的樣品前處理方法，測(cè)定其中的皂苷和黃酮兩類成分含量。

1 實(shí)驗(yàn)樣品、試劑及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

酸棗仁樣品購(gòu)自河北安國(guó)，產(chǎn)地為甘肅，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥種子。

1.2 藥品及試劑

對(duì)照品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度均大于98%。

乙腈(色譜純)購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；蒸餾水購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；其他溶劑均為分析純。

1.3 主要儀器

ACQUITY UPLC(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、ELS檢測(cè)器、TUV檢測(cè)器、Empower色譜工作站)(美國(guó)Waters公司)，AT261DeltaRange+w十萬(wàn)分之一天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)，F(xiàn)A210N電子天平(上饒市鴻翔實(shí)業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取4種對(duì)照品適量于5 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，得斯皮諾素2.110 mg·mL-1、6?-阿魏酰斯皮諾素1.950 mg·mL-1、酸棗仁皂苷A 2.176 mg·mL-1、酸棗仁皂苷B 1.004 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，并各取1 mL置5 mL的容量瓶中，定容，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY C18柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(0.1%甲酸)，梯度洗脫(0～4 min，14.5%～16%A；4～5 min，16%～20% A；5～9 min，20% A；9～11 min，20%～37% A；11～17 min，37% A；17～19 min，37%～100% A；19～22 min，100% A；22～24 min，100%～14.5% A；24～27 min，14.5% A)；體積流量0.3 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量3 μL；TUV檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；ELSD條件漂移管溫度60 ℃，氣壓25 psi。色譜圖如下圖1。

注：1.斯皮諾素；2.6?-阿魏酰斯皮諾素；3.酸棗仁皂苷A；4.酸棗仁皂苷B；A.對(duì)照品UV色譜圖；B：樣品UV色譜圖；C：對(duì)照品ELSD色譜圖；D：樣品ELSD色譜圖。圖1 酸棗仁4種成分的UPLC色譜圖

2.3 酸棗仁樣品前處理快速方法的建立

2.3.1 幾種提取方法和《中華人民共和國(guó)藥典》樣品處理方法的比較 《中華人民共和國(guó)藥典》方法(以下簡(jiǎn)稱藥典方法)：取本品粉末約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)適量，加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，加熱回流2 h，濾過(guò)，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液和濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[1]。

直接回流法：取本品粉末約1 g，精密稱定，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入70%乙醇30 mL，加熱回流(時(shí)間又分為10、20、30、40、60和120 min)，濾過(guò)，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液和濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

超聲提取法：取本品粉末約1 g，精密稱定，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，常溫超聲(超聲時(shí)間又分為30、60和90 min)，濾過(guò)，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液和濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

共10種不同的處理方法，各3個(gè)重復(fù)，斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B 4種成分的峰面積結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2各個(gè)處理4個(gè)成分的峰面積及顯著性差異分析結(jié)果可以看出，幾種加熱回流方法中，黃酮類的斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素加熱回流10～30 min峰面積呈上升趨勢(shì)，30～120 min呈下降趨勢(shì)，加熱回流30 min組高于與其他各回流組，且均有顯著性差異(6?-阿魏酰斯皮諾素的30 min組和40 min組無(wú)顯著差異)；皂苷類成分酸棗仁皂苷A加熱回流10～40 min呈上升趨勢(shì)，40～120 min略有下降，回流40 min組高于其他組，與10～30 min各組有顯著差異，而與60、120 min組無(wú)顯著性差異；酸棗仁皂苷B加熱回流10～60 min峰面積呈上升趨勢(shì)，回流120 min時(shí)峰面積略有下降，回流60 min組高于其他組，且均有顯著差異。因此兩類成分均表現(xiàn)為加熱回流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有含量降低的趨勢(shì)(可能發(fā)生了降解)，但是黃酮類成分降低幅度較大，綜合考慮兩類成分，加熱回流30 min為最佳的回流方法。

圖2 10種前處理方法結(jié)果(n=3)

幾種超聲方法中，斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素和酸棗仁皂苷A均表現(xiàn)超聲30～90 min峰面積呈上升趨勢(shì)，超聲90 min的峰面積最高，且均與30 min有顯著差異，斯皮諾素則與超聲60 min也有顯著差異。酸棗仁皂苷B則60 min的峰面積最高，與超聲30 min有顯著差異，但是與超聲90 min沒(méi)有顯著差異，綜合考慮兩種成分，超聲90 min為最佳超聲方法。

藥典方法的結(jié)果，除了酸棗仁皂苷B外，均顯著低于回流30 min的提取方法，也顯著低于回流時(shí)間120 min的提取方法，說(shuō)明藥典方法中較長(zhǎng)的回流時(shí)間會(huì)導(dǎo)致成分降解，特別是黃酮類，是不合適的，且脫脂的過(guò)程也使得一些成分丟失。超聲90 min的方法在皂苷類成分提取效果上和回流30 min無(wú)顯著差異，但黃酮類成分略低于回流的提取率，斯皮諾素低2.6%，6?-阿魏酰斯皮諾素低4.0%。但因超聲方法便利，且對(duì)于熱敏感的黃酮類成分更容易控制，因此本文推薦用超聲90 min的處理方法。

在超聲提取法中，又考察了提取溶劑(甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇)、提取物料比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40)對(duì)待測(cè)成分提取率的影響。最終優(yōu)化的提取條件為70%乙醇作為提取溶劑，物料比1∶30。

2.4 超聲提取法的方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL置5 mL的容量瓶中，定容，逐級(jí)稀釋，即得各系列的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照2.3項(xiàng)下條件進(jìn)樣3 μL，其中斯皮諾素和6?-阿魏酰斯皮諾素以UV檢測(cè)峰面積(Y)對(duì)對(duì)照品濃度(X，mg·L-1)進(jìn)行線性回歸，酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B以ELSD檢測(cè)峰面積的對(duì)數(shù)(Y)和對(duì)照品濃度的對(duì)數(shù)(X)進(jìn)行線性回歸，得各對(duì)照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍(表1)。

表1 酸棗仁中4個(gè)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液按2.3項(xiàng)下色譜條件，于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，對(duì)照品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B日內(nèi)峰面積RSD分別為1.73%、1.89%、2.74%、2.94%；連續(xù)3 d內(nèi)每天連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得日間峰面積RSD分別為2.54%、2.78%、3.15%、3.03%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末6份，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，計(jì)算斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的RSD分別為2.35%、2.05%、2.75%、3.32%，結(jié)果表示實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算斯皮諾素，6?-阿魏酰斯皮諾素，酸棗仁皂苷A，酸棗仁皂苷B 含量的RSD分別為2.43%、2.25%、2.83%、3.02%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的供試品粉末(WS-15)9份，每份各約0.5 g，精密稱定，置50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入各標(biāo)準(zhǔn)品斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B，按照2.1項(xiàng)下方法平行制備，2.3項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，測(cè)得四種化合物的平均回收率見(jiàn)表2，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確性較好。

表2 酸棗仁中4個(gè)成分的加樣回收率(n=3)

3 討論

本文為了簡(jiǎn)化酸棗仁含量測(cè)定的方法，在樣品前處理過(guò)程中考察了簡(jiǎn)單超聲提取法、直接加熱回流法和脫脂后加熱回流提取法(藥典方法)，通過(guò)比較斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B等4種成分的峰面積發(fā)現(xiàn)，加熱回流30 min是最佳方法，但超聲90 min的效果與之相差較小，且易于操作，因此推薦超聲90 min的方法。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法快速、準(zhǔn)確，為控制酸棗仁中黃酮類成分和皂苷類成含量的快速測(cè)定提供了可靠的方法。

本文的比較研究結(jié)果表明藥典方法測(cè)定的兩類成分偏低，使用本文提供的超聲方法，斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B等4種成分測(cè)得含量值分別比藥典方法高14.4%、10.8%、23.2%、2.2%。