HPLC同時測定五味子中7個木脂素類化合物的含量△

王書云，梁宏剛，黃健，王金輝*，楊寶峰

1.河南大學 藥學院，河南 開封 475004；2.哈爾濱醫科大學藥化教研室/省部共建生物醫藥工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081；3.沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016

五味子為木蘭科植物五味子SchisandrachinensisBaill.的干燥成熟果實，主產于遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古等地，故又稱北五味子。《神農本草經》列為上品，性溫，味酸、甘，歸肺、腎、心經，具有生津斂汗、益氣滋腎、寧心安神的作用，常用于久嗽虛喘、遺尿尿頻、心悸失眠等癥[1]。

五味子含有多種成分，主要成分為木脂素類，約占8%[2]。五味子中木脂素類化合物以聯苯環辛烯型木脂素類化合物為主，且為五味子中最主要的活性成分，如：五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛J、戈米辛K、當歸酰戈米辛H等[2-9]。

五味子為臨床常用中藥之一，具有保肝、鎮靜、催眠、保護腦神經細胞、提高記憶力、抗老年癡呆、提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等作用[10-18]，其質量優劣直接影響到臨床療效和用藥安全。影響藥材質量的因素很多，從產地、采收與加工，到五味子的炮制、運輸與貯存等方面，均對五味子藥材質量優劣產生影響。在前期對五味子指紋圖譜研究的基礎上，確定五味子中7個主要的化合物，并對這7個主要化合物進行提取、分離、鑒定，確定化合物為：五味子醇甲(1)、戈米辛D(2)、五味子醇乙(3)、當歸酰戈米辛H(4)、五味子甲素(5)、戈米辛N(6)、五味子乙素(7)，化合物結構見圖1。本文建立同時測定五味子中7個主要的聯苯環辛烯型木脂素類化合物含量的HPLC方法，為五味子的質量控制及保證五味子臨床用藥的安全、有效、質量可控提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(HPLC Waters 2690 Separations Module)，檢測器：Waters 2996 photodiode Array Detector，色譜柱：SunFireTMC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；KQ 5200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1004N電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；粉碎機(型號：FW-80，功率：460 W，轉速：24 000轉/min)；SPE固相萃取小柱(ODS，0.5 g)等。

1.2 試藥

液相分析用甲醇、乙腈為色譜純(J.T.Baker)；甲醇、乙醇、95%乙醇等分析純有機試劑(天津市富宇精細化工有限公司)；磷酸為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；實驗用水均為雙蒸水。

對照品五味子醇乙(成都生物制品檢定所，批號：MUST-13042601)；五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110857-201211、110765-200710、0764-200107)；戈米辛D、戈米辛N、當歸酰戈米辛H為實驗室自制，純度均大于98%。

五味子藥材分別購于沈陽、丹東、吉林、黑龍江等地藥材市場或藥店。

2 方法

2.1 色譜條件

SunFireTMC18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A(乙腈)-B(水)，梯度洗脫：0～10 min，38%～44%A；10～18 min，44%～45%A；18～28 min，45%～48%A；28～35 min：48%～60%A；35～37 min，60%～47%A；37～65 min，47%～48%A；65～67 min，48%～60%A；67～76 min，60%～61%A；76～78 min，61%～85%A，檢測波長：254 nm，柱溫：30 ℃，進樣量20 μL，理論塔板數以五味子醇甲計算，不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當歸酰戈米辛H適量，色譜甲醇溶解，配制成質量濃度分別為1.00、1.20、0.94、1.18、1.46、1.13、2.10 mg·mL-1的對照品儲備液。

分別精密吸取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當歸酰戈米辛H適量至5 mL容量瓶，色譜甲醇定容至刻度，搖勻，即得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當歸酰戈米辛H質量濃度分別為45.00、9.96、7.98、14.99、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合對照品溶液。

圖1 化合物的結構式

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取五味子藥材粉末約1.0 g，精密加入甲醇25 mL，稱質量，超聲30 min，冷卻，稱質量，補質量，精密取上清液2 mL過SPE柱，色譜甲醇洗3次，每次2 mL，將濾液轉移至10 mL量瓶，色譜甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，即得藥材供試品溶液。

3 結果

3.1 方法專屬性

分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液、藥材供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀測定，按2.1項下色譜條件進行分析，繪制高效液相色譜圖，見圖2。由色譜圖可知，在對照品色譜峰相應的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，且其他雜質對五味子多組分含量測定均無干擾，說明此方法專屬性良好。

注：A.對照品；B.樣品；1.五味子醇甲；2.戈米辛D；3.五味子醇乙；4.當歸酰戈米辛H；5.五味子甲素；6.戈米辛N；7.五味子乙素。圖2 對照品和供試品的HPLC圖

3.2 線性關系考察

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當歸酰戈米辛H質量濃度分別為45.00、9.96、7.98、14.99、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合對照品溶液過0.22 μm濾膜，分別精密進樣2、5、10、20、30、40、50 μL，按2.1項下色譜條件進行分析。以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得各化合物的回歸方程，見表1。

3.3 精密度試驗

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、當歸酰戈米辛H質量濃度分別為45.00、9.96、7.98、14.9、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合對照品溶液在2.1項下色譜條件連續進樣6針，進樣量20 μL，7個成分的RSD分別為0.93%、0.88%、0.31%、0.91%、1.86%、0.72%、1.41%(n=6)，說明儀器精密度良好，符合含量測定的要求。

3.4 重復性試驗

分別精密取五味子藥材粉末6份，每份約1.0 g，按2.3項下方法操作制備供試品溶液，分別進樣20 μL，在2.1項下色譜條件分析測定，7個成分的RSD分別為1.65%、1.54%、1.55%、1.80%、1.26%、1.94%、1.57%(n=6)，符合含量測定的要求。

3.5 穩定性試驗

按2.3項下方法制備的供試品溶液，在0、4、8、12、24、48 h，分別進樣20 μL，在2.1項下色譜條件分析測定，結果表明7個化合物在48 h內穩定，RSD分別為0.52%、1.58%、0.63%、1.51%、1.71%、1.41%、1.85%(n=6)符合含量測定的要求。

表1 五味子中7個主要木脂素含量測定的線性、檢測限及定量限

3.6 回收率試驗

精密稱取已知含量的五味子藥材粉末6份，每份約0.5 g，分別加入一定量的對照品，按2.3項下方法操作制備供試品溶液，分別進樣20 μL，在2.1項下色譜條件分析測定，結果見表2。

表2 五味子中7個木脂素含量測定的加樣回收率試驗結果(n=6)

3.7 樣品測定

分別精密稱取不同產地五味子藥材粉末約1.0 g，按2.3項下方法操作制備供試品溶液，分別進樣20 μL，在2.1項下色譜條件分析測定不同產地五味子中7個化合物的含量，結果見表3。

表3 不同產地五味子中7個木脂素的含量測定結果 mg·g-1

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

本文考察了SunFireTM(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Shimadzu vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Kromasil(150 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對五味子甲醇提取物的分離情況，綜合峰形、分離度、使用范圍等因素，選定SunFireTM色譜柱作為分析柱。

4.2 色譜條件的選擇

為了提高分析的靈敏度和精確度，本文考察了不同流動相組成(甲醇-水，乙腈-水溶液)對實驗結果的影響，結果表明，流動相采用水(A)-乙腈(B)梯度洗脫，能夠獲得良好的色譜分離效果。采用二極管陣列檢測器(190～800 nm)對檢測波長進行了考察，結果顯示，聯苯環辛烯型木脂素類化合物在254 nm處均有較好的紫外吸收，且色譜峰信息最為豐富，雜質較少，因此，選擇254 nm作為檢測波長。

4.3 供試品溶液制備的優化

為了使五味子中聯苯環辛烯型木脂素類化合物能被更完全地提取出來，本文首先對提取方式(超聲提取、回流提取、索氏提取)、提取溶劑(甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水、70%甲醇水、90%甲醇水)、料液比(10、20、25、50倍量)、提取時間(15、30、60、90 min)等影響因素進行考察，記錄色譜圖。結果顯示，以25倍量甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min制備樣品的色譜圖峰面積相對較大，化合物總含量相對較高，故最終確定供試品的制備方法：25倍量甲醇超聲提取30 min。

本文建立了同時定量測定五味子中7個主要木脂素類化合物的HPLC方法，并測定了收集到的不同產地的15批五味子樣品中7個主要木脂素類化合物的含量，結果發現，不同產地五味子中化合物的含量差別不大，7個木脂素的總質量分數最高為16.27 mg·g-1，最低為9.52 mg·g-1。該方法準確、可靠、重復性好，可用于五味子的質量評價。