崗梅花粉活力 柱頭可授性及種子發(fā)芽率研究△

蘭金旭，談英，劉暉暉*，邢建永，吳正軍，李子璇

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司 研發(fā)中心，廣東 深圳 518110；3西藏大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000

崗梅為冬青科冬青屬植物梅葉冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.的干燥根、莖，是我國清熱解毒類中成藥的原料藥，主要用于感冒靈、眾生丸等，在華南地區(qū)作為南方?jīng)霾璧闹饕煞謴V泛使用[1]。野生崗梅的自然生長速度較慢，近年來崗梅藥材應(yīng)用量增加導(dǎo)致野生資源蘊藏量急劇下降，目前需要通過人工種植增加崗梅資源量來逐步滿足市場需求。崗梅主要以種子繁育，在育苗過程中發(fā)現(xiàn)不同批次種子發(fā)芽率存在較大差異。植物開花傳粉是形成種子的關(guān)鍵步驟，花的結(jié)構(gòu)、開放時間、花粉和柱頭活力、繁育系統(tǒng)等決定著傳粉和授粉等有性生殖過程[2-4]，影響種子發(fā)育程度和發(fā)芽率。目前，崗梅研究在化學(xué)成分和藥理方面較多[5]，關(guān)于崗梅花的傳粉特性、種子發(fā)芽率方面較少[6-7]。本實驗對崗梅的花粉活力、柱頭可授性和開花習(xí)性進行研究，并檢測不同批次崗梅種子的千粒質(zhì)量和發(fā)芽率，了解崗梅的生殖生物學(xué)特性，為崗梅種子質(zhì)量提高、育種和人工栽培提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

崗梅花期、訪問昆蟲調(diào)查完成于廣東省平遠縣仁居鎮(zhèn)青草湖崗梅規(guī)范化種植基地，基地面積30 hm2；花粉活力、柱頭活性檢測材料來自于廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥王山。傳粉套袋觀察完成于藥王山的兩個種植種群，其中一個群落都為雌株，與另一個群落分別位于不同的區(qū)域，且周邊10 m內(nèi)無雄株存在。崗梅種子采收于廣東省平遠縣仁居鎮(zhèn)青草湖崗梅規(guī)范化種植基地，2016年6月15日至6月30日采收4批。崗梅植株經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)詹若挺研究員鑒定為梅葉冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.

1.2 方法

1.2.1 花期調(diào)查 以單塊地集中種植的崗梅種群為調(diào)查單位，該種群開花數(shù)量超過總花蕾數(shù)10%記為始花期，60%為盛花期；70%花脫落為結(jié)束期。計算雌雄株的開花持續(xù)時間。

1.2.2 花粉數(shù)量、活力及柱頭活性檢測 花粉數(shù)量統(tǒng)計采用顯微觀察法。隨機選取10朵花，分別將每朵花的全部花藥取出，放入離心管中破碎并定容至1 mL，搖勻后用移液槍取出0.1 mL稀釋至2 mL，再從2 mL中吸取20 μL放在載玻片上觀察，重復(fù)3次?；ǚ刍盍z測采用0.5% TTC(氯化三苯基四氮唑)溶液染色法[8]，隨機選取10朵花進行檢測。每朵花隨機選取10個分離的視野，每個視野不少于30?；ǚ?，統(tǒng)計視野中花粉的著色情況。活體花粉取自當(dāng)天開放的花朵；離體花粉取自開花前一天的花苞，剝開花瓣露出花藥，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每天10時檢測花粉活力。柱頭活性測定采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法[9]，選取不同開花天數(shù)雌花各5朵進行檢測，根據(jù)柱頭先端產(chǎn)生的氣泡數(shù)和染色深淺程度判定柱頭活性的大小。取下雌花的子房，用解剖刀沿心皮突起邊小心切下，于解剖鏡下觀察一個心皮內(nèi)的胚珠數(shù)。

1.2.3 訪問昆蟲 訪問昆蟲采用定點觀察法。觀察時間為2016年3月20日至3月27日，觀察時間9時至11時和15時至17時。記錄訪花昆蟲的種類、數(shù)目和訪問頻率。拍照得到的訪花昆蟲圖像由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所徐海明博士鑒定。

1.2.4 授粉方法 每個枝條中部僅保留1朵花，花苞階段套上硫酸紙袋，每個處理選擇20朵花，處理如下：1)僅套袋，在花朵開放后一直套袋，觀察是否存在無融合生殖；2)晴天人工授粉：在花朵開放的當(dāng)天，于上午9時用毛筆蘸取花粉進行授粉，完成后馬上套袋；3)雨天授粉：雨天待花開放后，用毛筆蘸取花粉進行授粉，結(jié)束后不再套袋；以不做任何處理為對照。處理后7 d調(diào)查授粉率和子房發(fā)育程度。

1.2.5 崗梅種子千粒質(zhì)量、發(fā)芽率檢測 參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》的方法，對不同批次崗梅種子的千粒重進行統(tǒng)計。隨機取1000粒種子稱重，重復(fù)3次，計算其平均值。

1.2.6 種子發(fā)芽率測定 崗梅種子需在一定溫度條件下進行層積處理，完成其生理后熟和形態(tài)后熟才能萌發(fā)。2016年6月15日、20日、26日和30日分四批采收，采取除去果肉清洗干凈，陰干后得到干凈種子。2016年8月2日，將崗梅種子與經(jīng)高溫滅菌處理的濕沙按照1∶3的比例混合均勻，濕度為65%，置于25～30 ℃的室溫下。2017年1月6日至7日以胚根突破種皮計算種子發(fā)芽率。

(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理

將調(diào)查的數(shù)據(jù)采用Spss(version 22.0)進行統(tǒng)計，方差分析采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 崗梅開花期物候和開花結(jié)果特性

崗梅植株嫩葉和花蕾在3月上旬開始出現(xiàn)，3月中旬花蕾膨大，雄花約為2 mm，雌花約為1 mm；雌株花蕾的出現(xiàn)晚于雄株2～3 d。3月20日，雄花從枝條中下部至中上部陸續(xù)開花，3月24日進入始花期，3月26日進入盛花期，4月5日花期結(jié)束。雌株在3月24日有花開放，3月27日進入始花期，3月29日進入盛花期，4月4日花期結(jié)束。雌株開花順序和雄株相似。5月下旬至6月上旬，雌花子房膨大約5～10 mm形成漿果。果皮顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色。6月中旬約10%崗梅果實轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色，果肉變軟進入成熟期，果實變軟后2～3 d自然脫落。7月上旬約90%的崗梅果實脫落。廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥王山上的雄株花期為4月7日至4月20日；而雌花的花期為4月10日至4月17日。

崗梅雄花花柄短，2～5 mm；3～5朵簇生，花白色，4～6瓣，覆瓦狀排列，雄蕊4～6枚，花絲長5 mm，子房敗育。雌花花柄長，8～20 mm；子房4～6室，柱頭4～6裂，花藥敗育。雄株開花早于雌株4 d。

2.2 崗梅花粉活力

崗梅雄花有4～6枚花藥，每朵花的花粉平均數(shù)量為16 587～21 717個，不同花的花粉粒數(shù)量差異較大。崗梅雌花具有4～6心皮，每心皮僅有1枚胚珠，發(fā)育成1個種子?；ǚ?胚珠比值(P/O)范圍在16 587～21 717，為典型的異花授粉，充足的花粉保證授粉的成功率(表1)。

表1 崗梅花粉粒數(shù)目

崗梅單朵雄花的壽命在1～3 d，在溫度較高、光照較強的情況下，花開放當(dāng)天就自然脫落。陰雨天氣，雄花在第2天或者第3天脫落。離體花粉活力在濕度為75%培養(yǎng)皿中，在開花前1天花粉達到70%，開花當(dāng)天達到91%，開花第2天達到70%，第3天迅速下降到30%(表2)。

表2 崗梅花粉活力測定

注：—表示雄花未開放或已脫落，未檢測花粉活力。

2.3 崗梅雌蕊柱頭可授性

崗梅雌蕊柱頭的顏色在開花后由淺綠色逐漸變?yōu)樯罹G色，并伴生有紅色斑塊，花柄從直立狀逐漸下垂，形成離層，易脫落。柱頭的可授性在開花后逐漸變?nèi)?。開花第1天，柱頭氣泡大量出現(xiàn)，顏色迅速變?yōu)樯钏{色；開花第3天，花柄從直立狀為下垂?fàn)?，氣泡?shù)量變少，柱頭變色時間增長，顏色變淺，柱頭的可授性開始下降(表3)?；ㄩ_放3～5 d后，花瓣開始脫落。

2.4 訪問昆蟲和授粉方法

崗梅植株開花過程，觀察到少量的東方蜜蜂ApisceranaFabricius、麻蠅SarcophagafuscicaudaB?ttcher等在花朵上停留，時間約1 s。其中多數(shù)造訪雌花，雄花數(shù)量極少。崗梅花部未觀察到明顯的蜜腺存在。套袋結(jié)果顯示，未能完成授粉的雌花在4 d后逐漸脫落。雄花在開花后2～3 d也自然脫落，不存在無融合生殖的現(xiàn)象。雨天人工授粉不成功。人工授粉率略高于自然授粉率。人工授粉后的雌花子房膨大速度超過自然授粉(表4)。

表4 不同授粉方法的授粉率和子房膨大速度(n=20)

注：-子房不膨大，+子房膨大正常，+++子房膨大速度較快。

表3 崗梅雌蕊柱頭可授性(n=5)

注：+氣泡數(shù)量或柱頭可授性弱；++氣泡數(shù)量多或柱頭可授性強；++++氣泡數(shù)量非常多或柱頭可授性非常強。

2.5 崗梅種子千粒質(zhì)量與種子發(fā)芽率

崗梅種子采收在6月中下旬完成，千粒質(zhì)量、發(fā)芽率隨著采收時間推遲而增加。6月15日采收種子的發(fā)芽率最低，為3%，千粒質(zhì)量也僅為4.63 g；6月30日采收種子的發(fā)芽率最高，為10.25%，千粒質(zhì)量為5.74 g。6月15日和6月30日采收種子千粒質(zhì)量和發(fā)芽率達到顯著性差異(表5)。6月20日和6月26日采收種子的千粒質(zhì)量和發(fā)芽率的差異不顯著，但與6月30日、6月15日采收種子千粒質(zhì)量和發(fā)芽率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，崗梅種子采收期、千粒質(zhì)量與發(fā)芽率之間呈極顯著相關(guān)(表6)。

表5 不同采收期種子千粒質(zhì)量及發(fā)芽率

注：不同小寫字母表示P<0.05。

表6 崗梅種子采收期、千粒質(zhì)量和發(fā)芽率相關(guān)性分析

注：**表示P<0.01。

3 結(jié)論與討論

崗梅花原為兩性花，但雄花子房敗育退化為葉枕狀，雌花花藥敗育為箭頭狀，形成單性花[10]?；ǚ?胚珠(P/O)比值也步表明崗梅為異花授粉植物。崗梅花被小、部分器官退化，花色白色，花粉量大，蜜腺不發(fā)達，具備典型風(fēng)媒花特征[11]。次序開花且花期較長，這也是風(fēng)媒花適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的策略。昆蟲訪問多數(shù)造訪雌花，是否與傳粉有關(guān)還需進一步研究。

風(fēng)媒花的傳粉受到環(huán)境影響較大，開花期物候中的雨季影響傳粉質(zhì)量[12]。通過2015年、2016年現(xiàn)場調(diào)查并參照歷年氣象記錄，發(fā)現(xiàn)崗梅開花初期氣溫較高，3月下旬連續(xù)降雨達到5～6 d，且以午后陣雨較多，此時崗梅植株正值開花期，降雨可能影響崗梅種子授粉，雨天人工授粉不成功也表明雨水沖刷影響傳粉質(zhì)量。種子千粒重和發(fā)芽率隨著采收時間推遲大幅度提高，進一步表明崗梅開花初期的降雨可能影響了前兩批種子的授粉質(zhì)量，導(dǎo)致種子發(fā)育程度較差，發(fā)芽率和千粒重較低。由于崗梅種子外面包被著果肉，難以從外表判斷種子發(fā)育狀況，因此建議崗梅種子在6月下旬采收，避開降雨時期形成的種子，從而確保良好的種子發(fā)芽率。