食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1的表達及其對食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706凋亡的影響

高明 劉麗英 李晟磊

[摘要] 目的 分析食管鱗狀細胞癌組織中B細胞轉位基因1（BTG-1）的表達及其對食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706凋亡的影響。 方法 選取鄭州大學第一附屬醫院2014年1月～2017年12月存檔的164個鱗狀細胞癌存檔手術或內鏡活檢蠟塊、76個癌旁正常組織手術蠟塊作為研究對象，采用免疫組化法、原位雜交檢測BTG1蛋白表達并分析其與病理參數的關系;建立BTG-1過量表達細胞株，AnncxinV-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測人食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706的凋亡情況。 結果 食管鱗狀細胞癌組織BTG-1蛋白、信使核糖核酸（mRNA）陽性表達率低于癌旁正常組織（χ2=32.718、55.729，均P < 0.001）;且有淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級Ⅱ～Ⅲ級標本中BTG-1蛋白、mRNA陽性表達率顯著較低（χ2=29.078、5.970、7.660、31.127、8.624、10.624，均P < 0.001）;且BTG-1組早期細胞凋亡率顯著高于空白對照組（t = 15.484，P < 0.001）。 結論 食管鱗狀細胞癌組織中BTG1的表達顯著低于癌旁正常組織，且其與有無淋巴結轉移、TNM分期、組織學分級的關系密切，BTG-1高表達或可促進食管鱗狀細胞癌細胞凋亡。

[關鍵詞] 鱗狀細胞癌;B細胞轉位基因1;食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706;凋亡

[中圖分類號] R735.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0007-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of B-cell translocation gene 1 （BTG-1） in tissue of esophageal squamous cell carcinoma and the effect on apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706. Methods A total of 164 paraffin blocks of squamous cell carcinoma collected through surgery or endoscopic biopsy and 76 adjacent normal tissue surgical blocks were collected from the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2014 to December 2017. The expression of BTG-1 protein and mRNA in the two groups were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization， and their relationships with pathological parameters were analyzed. The BTG-1 overexpressing cell line was established， and the apoptosis of human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706 was detected by AnnexinV-FITC/PI double labeling flow cytometry. Results The positive expression rates of BTG-1 protein and messenger ribonucleic acid （mRNA） in esophageal squamous cell carcinoma tissues were significantly lower than those in adjacent normal tissues （χ2=32.718， 55.729; all P﹤ 0.001）. The positive expression rates of BTG-1 protein and mRNA in specimens with lymph node metastasis， at TNM stage Ⅲ - Ⅳ and histological grade Ⅱ - Ⅲ were significantly lower than those without lymph node metastasis， at TNM stage Ⅰ - Ⅱ and of histological grade Ⅰ （χ2=29.078， 5.970， 7.660， 31.127， 8.624， 10.624; all P﹤0.001）. The early apoptosis rate in BTG-1 group was significantly higher than that in blank control group （t = 15.484， P < 0.001）. Conclusion The expression of BTG1 in tissues of esophageal squamous cell carcinoma is significantly lower than that in adjacent normal tissues. It is closely related to the presence of lymph node metastasis， TNM stage and histological grade. High expression of BTG-1 may promote the apoptosis of cell of esophageal squamous cell carcinoma.

[Key words] Esophageal carcinoma; B-cell translocation gene 1; Esophageal squamous carcinoma cell line EC9706; Apoptosis

食管癌具高浸潤、轉移特征，根據其組織學分型，主要有鱗狀細胞癌、腺癌、未分化癌等，其中以鱗狀細胞癌比例最高;因食管癌初期臨床癥狀不具特異性，多數患者就診時病情已進展至中晚期。當前針對食管癌的治療方式雖然較多，如放化療、生物治療、介入治療等，但仍未取得滿意效果，中晚期患者5年生存率仍僅為10%左右，其預后極差[1-4]。B細胞轉位基因1（B-cell translocation gene 1，BTG-1）是新發現的抑癌癥基因，屬BTG/Tob抗增殖基因家族一員，研究[5]指出，BTG-1在促進細胞凋亡、弱化腫瘤細胞侵襲轉移能力中發揮重要作用。近年來，BTG-1與前列腺癌、甲狀腺癌、婦科腫瘤等臨床病理參數的相關性及其在對應腫瘤疾病中的表達情況均獲得廣泛探討，但食管癌組織中BTG1的表達類研究相對少見[6-8]。鑒于此，現采集食管鱗狀細胞癌細胞標本研究探討，具體報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年12月鄭州大學第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）收治的食管癌患者，共計164例，均為鱗狀細胞癌存檔手術或內鏡活檢取樣蠟塊，其中76例存檔癌旁正常組織手術蠟塊。其中男96例，女68例;年齡37～75歲，平均（52.37±8.12）歲;組織學分型Ⅰ期104例，Ⅱ期34例，Ⅲ期26例;淋巴結轉移102例，無淋巴結轉移62例;TNM分期Ⅰ期60例，Ⅱ期48例，Ⅲ期39例，Ⅳ期17例;所存檔蠟塊患者均未經任意放化療或生物治療等積極治療。鱗狀細胞癌組織標本、癌旁正常組織標本獲取均經由患者知情同意，并獲得醫院醫學倫理委員會審核通批準。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試藥? 免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;原位雜交預交液、SA-Bio-AP、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;原位雜交5′端生物標記素、全硫代修飾探針均購自北京奧科生物技術有限責任公司;光學顯微鏡購自日本OLYMPUS技術公司;離心機購自北京離心機廠;蘇木素染色液購自天津化學試劑廠;BTG-1基因序列為：GCGATGGCTCTAGTCCAGATGC，獲取自NCBI網站，原位雜交5′端生物素標記、探針均購自北京奧科生物技術有限責任公司。

1.2.2 食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1表達? ①免疫組化法（SP）：存檔石蠟切片常規脫蠟、水化，抗原高壓修復后3%過氧化氫10 min阻斷內源性過氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉20 min，BTG-1抗體（1∶200）濕盒4℃過夜，滴加二抗，室溫濕盒內孵育20 min，滴加三抗，室溫濕盒內孵育20 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素染色液復染后分化、返藍，再常規脫水、透明、封片，常溫存檔2～3 d后顯微鏡下讀片;5個視野/切片，3張切片/標本，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為陰性對照。②原位雜交：切片重復脫蠟2次，10 min/次，梯度乙醇預處理5 min后置于焦碳酸二乙酯（DEPC）水中，0.5%過氧化氫室溫下滅活，暴露mRNA核酸片段，1%多聚甲醛/0.1 mol PBS（pH值7.2～7.6），1/1000 DEPC室溫固定;預雜交處理后滴加含標記探針的雜交液，劑量1 ng/L，蓋膜并在42℃條件下雜交12 h后檸檬酸鈉緩沖液（SSC，0.1×）洗脫非特異性雜交（15 min，42℃，4次），堿性磷酸酶底物（BCIP/NBT）顯色，顯色滿意后脫水、封固，室溫存放2～3 d后顯微鏡下讀片，以不含探針的標本為陰性對照組。③食管癌組織中BTG-1mRNA、蛋白陽性表達評分標準：陽性細胞百分比<5%記0分、5～25%記1分、>25%～50%記2分、>50%記3分;細胞無染色記0分、細胞染色呈淺黃色記1分、黃褐色記2分、棕黃色記3分，陽性細胞百分比與細胞染色程度記分之和≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.2.3 BTG-1對食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706凋亡的影響? 人食管鱗狀細胞癌細胞株培養至細胞密度70%～80%后分別加入1 mL含BTG-1基因的pLenti6-BTG1質粒的病毒液、含pLenti6/V5-DEST對照質粒病毒液繼續培養4 h后更換培養基，滴加5 μg/mL Blastidicin，10 d后篩選克隆接種于24孔培養板，細胞長滿后繼續擴大培養，篩選pLenti6/H1299細胞穩定轉染株為空白對照組、pLenti6-BTG1/H1299細胞穩定轉染株作為BTG-1組;參照AnncxinV-FITC/PI試劑盒操作說明書，將空白對照組、BTG-1組細胞接種于96孔培養板，每組設6孔，0.2%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞培養液并置于離心管，1000 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清，細胞計數板對細胞進行計數，選取1×105～5×105個/mL重懸細胞，100 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，棄上清液，500 μL結合液重懸，依次滴加5 μL AnncxinV-FITC、5 μL碘化丙啶，充分混勻后避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡，激發光波波長488 nm、發射光波波長530 nm，AnncxinV-FITC、PI分別為紅、綠色熒光，單個樣本檢測10 000個細胞，30 min內完成，以AnncxinV-FITC、PI單染OE-33細胞作為參照，CellQuest軟件計算細胞凋亡比，細胞凋亡情況壞死區（AnncxinV-FIT-、PI+，位于左上區）、晚期細胞凋亡區（AnncxinV-FIT+、PI+，位于右上區）、活細胞區（AnncxinV-FIT -、PI-，位于左下區）、早期細胞凋亡區（AnncxinV-FIT +、PI-，位于右下區）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1蛋白表達情況

食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1蛋白陽性表達率顯著低于癌旁正常組織，差異有高度統計學意義（χ2 = 32.718，P < 0.001）。見表1、圖1（封四）。

2.2 食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1mRNA表達

食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1mRNA陽性表達率顯著低于癌旁正常組織，差異有高度統計學意義（χ2=55.729，P < 0.001）。見表2、圖2（封四）。

2.3 不同病理特征的食管鱗狀細胞癌組織中BTG-1表達比較

鱗狀細胞癌組織中BTG-1蛋白、BTG-1 mRNA陽性表達在性別、年齡、組織學病理分型等方面差異無統計學意義（P > 0.05）;但有淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級Ⅱ～Ⅲ級鱗狀細胞癌組織標本中BTG-1蛋白、BTG-1 mRNA陽性表達率顯著較低（均P < 0.05）。見表3。

2.4 BTG-1對食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706凋亡的影響

BTG-1組早期細胞凋亡率[（10.46±0.87）%]顯著高于空白對照組[（2.27±0.96）%]，差異有高度統計學意義（t = 15.484，P < 0.001）。見圖3～4。

3 討論

食管鱗狀細胞癌作為預后較差的惡性腫瘤，其發生、發展雖與腫瘤細胞過度增殖、分化能力降低有密切關系[9-12]，但腫瘤細胞的持續生長僅靠增殖抑制只能取得延緩獲益，如何誘導腫瘤細胞凋亡才是腫瘤細胞縮小、消失的根本途徑[13-16]。然而，細胞凋亡既可發生于生理條件、亦可發生于病理條件。一般來說，細胞死亡過程具自發性、程序化特征，而這一過程又受多種因素影響，并涉及與其相關的多個基因變化，通過對腫瘤細胞誘導促進其凋亡對食管鱗狀細胞癌的臨床診治有重要意義[17-18]。BTG-1是定位于第8～12號染色體的BTG/Tob抗增殖基因家族成員之一，分子質量1.9×104，含5620個堿基對，可編碼171個氨基酸，作為抗增殖基因家族中的一員，其減緩細胞增殖的作用已相對明確[19-20]。隨著研究深入，BTG-1在機體病理、生理發展過程中所發揮的重要作用被廣泛重視。有報道[21]指出，BTG-1高表達可通過對促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白間的平衡調控作用促進細胞凋亡。

本研究亦顯示，食管鱗狀細胞癌組織標本中BTG-1蛋白、mRNA陽性表達率顯著低于癌旁正常組織，且有淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級Ⅱ～Ⅲ級標本中BTG-1蛋白、mRNA陽性表達率分別顯著低于無淋巴結轉移跡象、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、組織學分級Ⅰ級標本（P < 0.05），這與馮盼盼等[22]的報道結論相似，其研究對象為胃腺癌組織，較正常癌旁組織黏膜組織，胃腺癌組織中BTG-1蛋白、mRNA明顯低表達，并與腫瘤細胞TNM分期、淋巴結轉移顯著相關，提示腫瘤組織中BTG-1蛋白表達量與腫瘤疾病發展密切相關;且經AnncxinV-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測，BTG-1組早期細胞凋亡率顯著高于空白對照組，提示BTG-1高表達或可促進腫瘤細胞凋亡;這與孫國貴等[23]報道結論相符，其報道BTG-1轉染可促進肺癌細胞早期凋亡;但當前針對BTG-1對食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706細胞凋亡的相關研究十分鮮見，且細胞凋亡過程極為精密、復雜，并涉及多種基因、調控因子，如癌癥基因、抑癌基因、各種調控基因等，從基因表達、信號傳導等途徑探究BTG-1對食管鱗狀細胞癌細胞凋亡的影響仍有極大的探究空間。

綜上所述，食管鱗狀細胞癌組織存在BTG-1低表達現象，BTG轉染對食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706凋亡有明顯促進作用，或可為食管鱗狀細胞癌臨床治療提供新方向。

[參考文獻]

[1]? Hyland PL，Han Z，Qi Y，et al. Pathway，in silico and tissue-specific expression quantitative analyses of oesophageal squamous cell carcinoma genome-wide association studies data [J]. Int J Epidemiol，2016，45（1）：206-220.

[2]? Arnold M，Laversanne M，Brown LM，et al. Predicting the Future Burden of Esophageal Cancer by Histological Subtype：International Trends in Incidence up to 2030 [J]. Am J Gastroenterol，2017，112（8）：176-180.

[3]? 李朝慧，任本洪，孫雪嬌，等.順鉑耐藥對食管癌細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成的影響[J].中國病理生理雜志，2017，33（1）：1-6.

[4]? 王修身，張羲茜，劉曉，等.食管癌同步放化療的療效及預后因素分析[J].中華放射腫瘤學雜志，2017，26（4）：400-404.

[5]? 呂赤，蘇琪.結腸癌中BTG3蛋白表達及臨床意義[J].臨床軍醫雜志，2016，44（12）：1256-1258.

[6]? 張鵬飛，陰繼凱，袁利娟，等.miR-139通過沉默B細胞轉位基因3（BTG3）抑制肝細胞癌細胞的增殖[J].細胞與分子免疫學雜志，2017，33（11）：1516-1520.

[7]? 何洪杰，于景翠.抗增殖家族成員TOB1基因與腫瘤[J].臨床腫瘤學雜志，2015，20（3）：262-265.

[8]? 宋琦，蔣冬先，侯英勇.食管鱗狀細胞癌的分子生物學研究進展[J].中華病理學雜志，2016，45（3）：217-220.

[9]? 劉濤，李濤.食管癌的手術治療及非手術治療研究進展[J].醫學綜述，2016，22（3）：505-507.

[10]? 張桂芳，孟令新，丁兆軍.分子靶向治療食管癌的研究進展[J].中國醫師雜志，2015（z2）：226-229.

[11]? 彭磊.人類ErbB-2轉錄因子1基因相關信號通路的研究進展[J].腫瘤研究與臨床，2016，28（6）：422-426.

[12]? Bai Y，Qiao L，Xie N，et al. Expression and prognosis analyses of the Tob/BTG antiproliferative （APRO） protein family in human cancers [J]. PLoS One，2017，12（9）：e0 184 902.

[13]? 陳靜，周中成，劉文斌，等.BTG3在胰腺導管腺癌中的表達及其預后價值[J].中華外科雜志，2017，55（11）：863.

[14]? 賀宇彤，李道娟，梁迪，等.2013年中國食管癌發病和死亡估計[J].中華腫瘤雜志，2017，39（4）：315.

[15]? 馬鵬，馮俊，彭濤.凋亡抑制基因Livin在喉鱗狀細胞癌中的表達及與預后的關系[J].成都醫學院學報，2017， 12（4）：439-443.

[16]? 楊東梅，于紅剛.Paxillin在消化系統惡性腫瘤發生發展中的研究進展[J].疑難病雜志，2018，17（4）：424-427， 432.

[17]? 劉春濤，姜大磊，張政，等.叉頭蛋白M1在食管鱗狀上皮異型增生至癌變過程中的表達及其與臨床病理的相關性[J].臨床和實驗醫學雜志，2017，16（17）：1668-1672.

[18]? Micheli L，Ceccarelli M，Farioli-Vecchioli S，et al. Control of the Normal and Pathological Development of Neural Stem and Progenitor Cells by the PC3/Tis21/Btg2 and Btg1 Genes [J]. J Cell Physiol，2015，230（12）：2881-2890.

[19]? Zhu R，Li W，Xu Y，et al. Upregulation of BTG1 enhances the radiation sensitivity of human breast cancer in vitro and in vivo [J]. Oncol Rep，2015，34（6）：3017-3024.

[20]? Nan YH，Wang J，Wang Y，et al. MiR-4295 promotes cell growth in bladder cancer by targeting BTG1 [J]. Am J Transl Res，2016，8（11）：4892-4901.

[21]? Lu K，Liu C，Tao T，et al. MicroRNA-19a regulates proliferation and apoptosis of castration-resistant prostate cancer cells by targeting BTG1 [J]. FEBS Lett，2015，589（13）：1485-1490.

[22]? 馮盼盼，李風鴿，王恒，等.B細胞轉位基因-1在胃腺癌組織的表達及臨床意義[J].中華實驗外科雜志，2016， 33（6）：1643-1645.

[23]? 孫國貴，張潔，崔大為，等.BTG1在非小細胞肺癌中的表達及其對肺癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉移的作用[J].臨床腫瘤學雜志，2014，19（11）：972-976.

（收稿日期：2018-05-22? 本文編輯：王? ?蕾）