時間分辨熒光法檢測乙肝表面抗原LOD及參考區間的驗證和建立

黃利君 常凡 莫展

[摘要] 目的 驗證時間分辨熒光分析法檢測乙肝表面抗原（HBsAg）的檢出限（LOD），評價參考區間的合適性。 方法 自2017年10月～2018年1月對HBsAg二級標準物倍比稀釋后采用時間分辨熒光分析法及酶聯免疫吸附法（ELISA）進行配對檢測，標準物濃度除以稀釋后檢測結果出現陰性的上一稀釋度為LOD，驗證廠商的聲明，比較兩種方法檢測同一稀釋度樣品結果，評估廠商聲明的參考區間的合適性;根據美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）EP17-A2規定的方法建立空白限（LOB）及LOD，評價已建立的LOD作為參考區間上限的合適性。 結果 時間分辨熒光法的LOD驗證結果為0.1 U/mL，與廠商聲明相符。如使用時間分辨熒光檢測系統廠商聲明的參考區間，標準物稀釋3倍后結果判為假陰性，與ELISA檢測結果不符。重慶醫科大學附屬永川醫院（以下簡稱“我院”）檢驗科建立的HBsAg的LOB及LOD分別為0.048 ng/mL及0.137 ng/mL，如以我院檢驗科建立的LOD制訂參考區間，稀釋3倍后兩種方法結果一致，均為陽性。 結論 時間分辨免疫熒光分析系統聲明的LOD可以接受，但廠商聲明的參考區間不適宜，易導致假陰性。檢驗科應建立自己的LOD來制訂參考區間。建議在對病毒標志物定量檢測項目進行性能驗證時增加參考區間的驗證。

[關鍵詞] 乙肝表面抗原;EasyCuta全自動時間分辨免疫熒光分析;LOD;參考區間

[中圖分類號] R446.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0149-04

[Abstract] Objectives To verify the detection limit （LOD） of hepatitis B surface antigen （HBsAg） by time-resolved fluorimmunoassay， and to evaluate the suitability of the reference interval. Methods From October 2017 to January 2018， the HBsAg secondary standard substance was diluted and then paired with time-resolved fluorescence method and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for detection， the detection limit was the last dilution degree with negative test results after standard substance concentration divided by dilution， to verify the manufacturer′s statement， the results of samples with the same dilution degree detected by the two methods was compared， and the suitability of the reference interval declared by the manufacturer was evaluated. According to the American clinical laboratory standards board （CLSI） EP17-A2 method， create blank limits （LOB） and LOD， and the suitability of the established LOD as the upper limit of the reference interval was evaluated. Results The detection limit of time-resolved fluorimmunoassay method was 0.1 U/mL， which was consistent with the manufacturer′s statement. If the reference interval declared by the manufacturer of the time-resolved fluorimmunoassay detection system was used， the standard substance was diluted 3 times and the result was found to be false negative， which was inconsistent with the ELISA test result， the LOB and LOD of HBsAg established in Department Clinical Laboratory， Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University （hereinafter heferred to as "our hospital"）， were 0.048 ng/mL and 0.137 ng/mL， respectively. If the reference interval was established with the LOD established chinical laboratory of our hospieal， the results of the two methods were consistent after 3 times of dilution， and both were positive. Conclusion The detection limit declared by the time-resolved fluorimmunoassay analysis system is acceptable， but the reference interval declared by the manufacturer is not appropriate， which is likely to lead to false negative. The clinical laboratory should establish its own LOD to establish the reference interval. It is suggested to increase the validation of the reference interval in the performance verification of the quantitative detection items of virus markers.

[Key words] Hepatitis B surface antigen; EasyCuta automatic time-resolved fluorescence immunoassay; Limit of detection; Reference interval

目前定量檢測病毒標志物的方法（如時間分辨熒光分析法及化學發光方法）雖聲稱是一個定量實驗，但其本質就是一個通過參考區間對定量結果進行陰陽性判斷的定性實驗，其聲明的參考區間的上限其實就是檢出限（LOD）。以前關于LOD概念的理解不一，導致各實驗室對LOD的建立及驗證方法不統一[1-3]。LOD是指樣本中可被檢測到的最低分析物濃度，可以在規定的可能性條件下予以檢出[4-5]，亦即是C95濃度（進行100次檢測有95次檢測結果為陽性的濃度）[6-7]。LOD代表定性實驗的診斷靈敏度，它不同于空白限（LOB）即C50濃度（進行100次檢測有50%的結果為陽性，50%的結果為陰性），許多實驗室卻誤把LOB作為LOD。目前雖有關于時間分辨熒光分析法LOD驗證的文獻報道[8]，但報道誤把LOB作為LOD及參考區間下限進行了評估、驗證，且我們工作中發現如參照廠商聲明的參考區間，一些弱陽性標本在時間分辨檢測系統上檢測結果為假陰性。乙肝表面抗原（HbsAg）是一個診斷乙肝的重要指標，如因HBsAg參考區間不適而導致乙肝漏檢，會給臨床診斷、獻血人員及器官移植等導致嚴重后果，因此，有必要對時間分辨檢測系統檢測HBsAg的LOD及參考區間均進行驗證、評價，適當時重新建立LOD和/或參考區間。

1 材料與方法

1.1 一般材料

自2017年10月～2018年1月采用HBsAg二級標準物（購自于國家標準物質網，濃度：0.2 U/mL）作為LOD及參考區間的驗證樣本，使用樣品稀釋液制備5個空白樣本，并通過空白樣本測量數據的統計分析得到的LOB;用HBsAg定量校準品（購自新波生物，濃度：0.21 ng/mL）制備HBsAg濃度值介于LOB（1～4）倍的4個低濃度樣本（濃度分別為0.050、0.100、0.015、0.210 ng/mL）作為LOD建立的樣本[5，9]。

1.2 儀器與試劑

EasyCuta全自動時間分辨免疫熒光分析儀：（生產廠家：新波生物技術有限公司）;MB-580型酶標儀：（生產廠家：深圳匯松科技發展有限公司）;HBsAg定量檢測試劑盒：（生產廠家：新波生物技術有限公司;批號1：8600073730，批號2：86000752000）;乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原診斷試劑盒：（生產廠家：珠海麗珠，批號：B20170820）。

1.3 方法

1.3.1 LOD驗證? 對HBsAg標準品進行1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的倍比稀釋，每個稀釋度同時使用時間分辨熒光分析法及酶聯免疫吸附實驗（ELISA）進行檢測，對二者結果進行比較評價，標準物濃度除以稀釋后檢測結果剛好出現陰性的上一稀釋度為LOD。如驗證所得的LOD≤廠商聲明的LOD，則廠商聲明的LOD可以接受，否則不能接受，需重新建立LOD。

1.3.2 參考區間驗證? 將兩種方法檢測HBsAg標準品系列倍比稀釋后樣品的定性結果（即陰陽性結果）進行比較，以ELISA結果作為參考結果，評價廠商提供的參考區間的合適性（時間分辨免疫熒光分析檢測系統檢測HBsAg是根據廠商提供的參考區間作為陰陽性判斷標準，大于參考區間上限即為陽性，參考區間內為陰性），適時建立LOD。

1.3.3 時間分辨檢測系統LOD的建立? 采用EP17-A2推薦方法[5，9]，對EasyCuta全自動時間免疫熒光分析儀進行校準，嚴格按照標準作業程序（SOP）文件進行操作，每個空白樣本每天測量4次，連續測定3 d，獲得60個數據;每個低濃度樣本每天測5次，連續測量3 d，獲得60個數據。每批測量均做室內質控，剔除失控批次的測量值，糾正失控后重做，按照“1/3”原則剔除離群值，剔除的離群值需重新測量進行補充。設定Ⅰ類錯誤（α）和Ⅱ類錯誤（β）均為5%，即α = β = 5%，并根據檢測結果的正態分布情況選擇使用參數方法或非參數方法建立LOB及LOD。

1.4 統計學方法

使用SPSS 17.0對檢測結果進行正態分布性檢驗，根據結果選擇參數或非參數方法建立LOB或LOD。

2 結果

2.1 廠商聲明LOD的驗證

根據廠商提供的參考區間，標準物稀釋2倍時，時間分辨熒光分析法檢測結果為陽性，稀釋3倍時檢測結果為陰性，因此其LOD為0.1 U/mL（0.2/2），與廠商聲明的LOD一致，可以接受。此外，根據時間分辨系統廠商提供的參考區間，當室內質控品稀釋2倍時，兩種方法定性檢測結果一致（均為陽性），稀釋3倍時，時間分辨熒光分析法定性檢測結果為陰性，而ELISA定性檢測結果仍為陽性。見表1。

2.2 LOB及LOD的建立

2.2.1 LOB的建立? LOB空白樣本測定結果，見表2，經正態性檢驗呈非正態分布，依據EP17-A2，使用非參數程序估計LOB，LOB = PctB100-α，即第95百分位數值為LOB，得到第95百分位數值為第57和第58個測量結果的均值。將空白樣本的60個檢測數據按從小到大的順序排列，第57、58個位置上的檢測值均為0.048 ng/mL，故LOB = X57+0.5（X58-X57）=0.048 ng/mL。

2.2.2 LOD的建立? LOD4個低濃度樣本測定結果，見表3，經正態性檢驗呈非正態分布，依據EP17-A2，使用非參數程序估計LOD，即LOD = LOB+DS.β，DS.β是系列低濃度樣本測定結果中位數的值與系列低濃度樣本測量結果第5百分位數值之差，可得出DS.β = 0.089 ng/mL，則LOD = 0.137 ng/mL。

3 討論

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共衛生問題。中國每年約有30萬人死于HBV相關肝癌或肝硬化，占全球HBV相關死亡人數的37%～50%[10-12]，除損傷肝臟外，還可引起腎病、心肌損害和膽管炎等[13-14]。HBV主要傳播途徑為血液傳播（如輸血過程中感染）、醫源性感染、母嬰傳播和性傳播，最新報道[15-16]表明其在醫院醫師職業暴露中占首位。HBsAg作為HBV感染的標志物，在0.1 μg/L水平即具有傳染性，因此在乙型肝炎的診斷、術前檢查、輸血前檢查和獻血人員的篩選方面都有重要的臨床意義[17-18]。有報道[19]表明，時間分辨熒光分析法檢測HBsAg雖具有較高的靈敏度（96.97%），但在臨界濃度附近仍存在陰陽性不一致的情況，據統計學分析，臨界濃度各有50%的假陽性和假陰性，因而，驗證及建立檢測限對于臨床實驗室能最大限度地檢出可疑標本，避免漏檢顯得十分重要[20]。

因陽性室內質控物或標準物質的濃度單位均為U/mL，臨床診斷明確的患者樣本，又無法對其HBsAg準確賦值，因此時間分辨熒光檢測系統廠商聲明的HBsAgLOD（0.1 U/mL）也是使用的U/mL單位，據此，本研究亦采用稀釋標準物進行檢測的方法進行驗證，驗證結果與廠商聲明的一致。

從本研究ELISA法及時間分辨熒光分析法配對實驗結果可以看出：稀釋2倍時，二者的定性結果一致。當樣本稀釋3倍時，二者結果不一致：ELISA測量的S/CO為0.1443，高于Cutoff值（0.105），也超過Cutoff值的灰區范圍（0.105±20%），可以非常確切地判斷為陽性，而時間分辨測量結果為0.156 ng/mL，如果按照廠商聲明的參考區間（<0.2 ng/mL），應該判為陰性。因此，對于濃度在0.137～0.200 ng/mL范圍區間的樣本使用廠商聲明的參考區間易導致假陰性，廠商聲明的參考區間不合適，易導致臨床漏診，檢驗科應該根據自行建立的LOD建立參考區間。

LOD應作為參考區間上限，亦既是C95濃度。我院檢驗科室自行建立的LOB及LOD分別為0.048 ng/mL及0.137 ng/mL（LOD低于廠家聲明的0.200 ng/mL參考區間上限），據此我們建立的參考區間為<0～0.137 ng/mL。在兩種方法配對實驗中，使用我們建立的參考區間，標準物稀釋3倍時，時間分辨檢測系統檢測結果（0.156 ng/mL）應判為陽性，就與ELISA一致了。當樣本稀釋4倍時，雖然兩種方法檢測結果不一致：時間分辨檢測結果為陰性（使用本研究LOD即0.137 ng/mL作為參考值），ELISA檢測結果為陽性，但結果均處于灰區，處于灰區的結果具有不確定性[21-23]，需進一步確認，因此僅憑這一次實驗結果尚不能確定二者測量結果的不一致。

如果采用我院檢驗科建立的LOD作為判斷陰陽性的閾值，從時間分辨熒光法及ELISA配對實驗結果可以看出，標準物質（濃度為0.2 U/mL）稀釋3倍后兩種方法的測量結果一致，仍為陽性，那么時間分辨檢測系統的LOD（以國際單位作為濃度單位）應為0.07 U/mL（0.2/3），小于廠商聲明的0.1 U/mL，廠商聲明亦可以接受。

綜上所述，時間分辨免疫熒光法廠商聲明的LOD在實驗室得到驗證，廠商聲明的參考區間不合適，易導致誤診，實驗室應建立自己的LOB及LOD，應以LOD作為分析閾值，建立參考區間。因此在病毒標志物定量檢測項目的性能驗證中除驗證CL39明確要求的符合率、LOD外，建議實驗室增加驗證廠商聲明的參考區間。

[參考文獻]

[1]? 唐恩躍，何增品，崔曉花，等.基于CLSI EP12-A2文件要求的乙型肝炎五項定性檢測性能驗證[J].國際檢驗醫學雜志，2016，37（24）：3443-3444.

[2]? 方婉仙，李志雄，董志寧，等.總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發光免疫分析法）的性能驗證[J].分子診斷與治療雜志，2015，7（5）：323-327.

[3]? 沙廣群，王啟龍，劉萍，等.游離前列腺特異性抗原性能指標的建立[J].檢驗醫學與臨床，2017，14（14）：2097-2099.

[4]? 張秀明，馮仁豐.正確理解和使用分析靈敏度及LOD[J].中華檢驗醫學雜志，2014，37（9）：669-672.

[5]? CLSI. Evaluation of detection capability for clinical laboratory measurement procedures [M]. PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

[6]? 楊有業，張秀明.臨床檢驗方法學評價[M].北京：北京人民衛生出版社，2008：142-167.

[7]? CLSI. EP12-A2 User protocol for evaluation of qualitative test performance;approved guideline [S]. PA，USA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2009.

[8]? 黃永富，黃介飛，叢輝，等.時間分辨熒光免疫分析法檢測乙型肝炎血清標志物的分析方法性能驗證[J].國際檢驗醫學雜志，2011，32（5）：543-547.

[9]? 康鳳鳳，王薇，王治國.臨床實驗室檢測方法空白限、LOD和定量限評價新方法[J].中國衛生統計，2014，31（5）：901-904.

[10]? Ji Z，Wang T，Shao Z，et al. A population-based study examining hepatitis B virus infection and immunization rates in Northwest China [J]. PLoS One，2014，9（5）：e97 474.

[11]? 何龍芳.抗病毒治療停藥后乙型肝炎復發與血清HBV DNA水平的相關性分析[J].中國醫藥科學，2017，7（21）：251-254.

[12]? 趙薇.血清中乙型肝炎病毒轉錄的檢測在母嬰垂直傳播中的臨床意義[J].中國醫藥導報，2017，14（15）：117-120.

[13]? Trépo C，Chan HL，Lok A. Hepatitis B virus infection [J]. The Lancet，2014，384（9959）：2053-2063.

[14]? Cai QC，Zhao SQ，Shi TD，et al. Relationship between hepatitis B virus infection and chronic kidney disease in Asian populations：a meta-analysis [J]. Ren Fail，2016， 38（10）：1581-1588.

[15]? 張紅巖，仲曙光.醫院醫師職業暴露危險因素監控與防護對策分析[J].中國病原生物學雜志，2017（9）：851-854.

[16]? 姜新華，高國生，胡愛榮.國產PCR試劑和COBAS系統血清HBV-DNA檢測結果不一致的原因分析[J].中國現代醫生，2017，55（2）：108-101.

[17]? 陳德娟.輸血和手術前患者血清5項感染性指標調查結果分析[J].中國病原生物學雜志，2013（4）：355-357.

[18]? 曾健強，聶冬梅，馬蘭，等.深圳無償獻血乙肝篩查陽性結果確證分析[J].實用預防醫學，2006，13（2）：258-259.

[19]? 莫展，曾強，冉季于，等.時間分辨熒光免疫技術測量乙肝標志物可疑結果分析與處理[J].中國衛生檢驗雜志，2014（15）：2188-2190.

[20]? 李金明.定性測定的性能驗證[C]//中華醫學第九次全國檢驗醫學學術會議暨中國醫院協會臨床檢驗管理專業委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學術會議，北京，2011：45-46.

[21]? 陳洪生，陳佳微，張三明，等.ELISA“灰區”范圍的設定對獻血者血液檢測安全和血源保護的意義[J].中國輸血雜志，2015，28（9）：1140-1141.

[22]? 張艷麗.HBsAg ELISA灰區、弱反應標本與FQ-PCR檢測結果對比分析[J].臨床血液學雜志（輸血與檢驗），2016（5）：794-796.

[23]? 陳靜，李幫芬，先秀，等.酶聯免疫四項檢測結果灰區與窗口期感染的關系[J].檢驗醫學與臨床，2017，14（17）：2554-2556.

（收稿日期：2018-07-30? 本文編輯：封? ?華）