番茄抗TYLCV分子標記輔助聚合育種

侯富恩 郝科星 張濤 蘇東濤 王銘

摘 要： 為了培育對TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）抗性穩定持久、園藝性狀優良的番茄品種，以分別含有Ty-1、Ty-2、Ty-3的3個抗源材料‘TY52‘CLN2777A‘R1164為供體親本，2個園藝性狀優良的不含抗病基因的育種材料‘TMX255-1‘TMX255-5為受體親本，通過雜交和多代回交自交，同時利用分子標記輔助選擇技術、苗期接種技術和農藝性狀觀察對后代進行篩選，將Ty-1與Ty-2導入并聚合到‘TMX255-1，Ty-1與Ty-3導入并聚合到‘TMX255-5，最終獲得2份聚合了不同抗病基因的株系，分別命名為‘TY1-2‘TY1-3，并對其進行了抗性評價，結果顯示，2份株系對TYLCV整個生育期在田間都表現抗病，且園藝性狀優良穩定，可以作為自交系應用于抗病育種中。

關鍵詞： 番茄； TYLCV； 分子標記； 聚合育種

Abstracts： In order to breed tomato varieties with excellent resistance to TYLCV （Tomato yellow leaf curl virus） and good horticultural traits， two TYLCV susceptible tomato lines ‘TMX255-1，‘TMX255-5 were used as recipient parents to cross and backcross with the three donor parents ‘TY52，‘CLN2777A，‘R1164，which contained Ty-1，Ty-2，Ty-3，respectively. Molecular marker-assisted selection（MAS）， seedling inoculation identification and observation of agriculture characters were used in each backcross and self-cross progeny selection， and two pyramided lines were obtained which named ‘TY1-2 and ‘TY1-3. The evaluation of resistence level of two pyramided lines showed that the pyramided lines which carried both resistance genes were resistant to tomato leaf curl disease throughout its life cycle in the field and exhibited excellent horticultural traits. So the lines could be used as inbred lines in resistance breeding.

Key words： Tomato； TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）； Molecular marker； Pyramid

番茄黃化曲葉病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是目前我國番茄生產上的重要病害之一，植株感病后會表現出葉片卷曲、黃化、生長停滯等現象，嚴重時會導致大面積絕收[1-6]。導致該病發生的病原為番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），該病毒屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），是一類具有孿生顆粒形態的單鏈環狀DNA植物病毒，其基因組重組發生率和變異頻率較高[7]。利用分子標記輔助選擇技術聚合多個抗TYLCV基因，是培育具有持久抗性品種最有效的策略[8]。因此，筆者結合苗期接種鑒定、分子標記輔助選擇和田間性狀觀察，初步研究番茄不同抗TYLCV基因聚合后抗性表現的差異，建立番茄抗TYLCV聚合育種的分子標記輔助選擇體系，以獲得抗性高且不再分離同時性狀優良的自交系，為番茄優質、抗病育種創制新的種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料

3份含有TYLCV抗性基因材料‘TY52‘CLN2777A‘R1164（分別含有Ty-1、Ty-2、Ty-3），其中‘TY52‘CLN2777A由亞洲蔬菜研究發展中心提供，‘R1164由雜交品種的分離后代選育而成。2份受體親本材料‘TMX255-1‘TMX255-5（不含TYLCV抗性基因），是由山西省農業科學院農業資源與經濟研究所自主選育的純合自交系。感病對照為‘Moneymaker，該品種在山西地區對TYLCV表現為高感。

1.2 接種鑒定

病毒接種采用大田自然接種法，試驗于2012—2017年在山西省農科院榆次東陽溫室試驗基地進行，1年2代。6—10月份為煙粉虱發病高峰季節，這期間在發病嚴重的溫室內育苗，使植株在苗期感染TYLCV，同時控制蟲口數量，7～10 d噴1次殺蟲藥，以免對植株造成傷害。定植時選擇TYLCV發病嚴重的溫室，同樣也需注意蟲口數量，定期噴施殺蟲劑。參照L. Mejía和R. E. Teni等[9]定植30 d和60 d后進行病情調查，根據發病情況對所有植株病情嚴重指數（disease severity index，DSI）進行統計，統計結果按照發病嚴重程度分為0～4級：0級，無任何感病癥狀；1級，頂端葉邊緣黃化；2級，頂端小葉變黃并發生輕微卷曲；3級，大范圍葉片變黃，卷曲嚴重，植株生長量小；4級，癥狀非常嚴重，植株矮化，基本停止生長[10]。

1.3 抗TYLCV基因聚合過程

2012年種植所有親本材料‘TMX255-1‘TMX255-5‘TY52‘CLN2777A‘R1164，按計劃配制雜交組合，獲得（‘TMX255-1בTY52）F1，（‘TMX255-1בCLN2777A）F1，（‘TMX255-5בTY52）F1，（‘TMX255-5בR1164）F1，2012年下半年開始，將獲得的F1分別回交，每一代都利用分子標記檢測，同時結合農藝性狀觀察，在回交后代中篩選含有抗病基因的優良單株留種并繼續回交。在連續回交6代后，遺傳背景基本恢復，2015年下半年將2個方向的回交后代進行雜交，從雜交后代中篩選同時含有2個抗病基因的單株自交并留種，再從自交后代中篩選同時含有2個抗病基因，且純合的單株進行留種，并對后代進行性狀調查，篩選性狀與輪回親本一致的植株留種，繼續自交留種，最終于2017年下半年獲得2份分別聚合了Ty-1和Ty-2，Ty-1和Ty-3，遺傳背景分別與輪回親本‘TMX255-1‘TMX255-5基本一致，且高抗TYLCV的番茄品系，分別命名為‘TY1-2‘TY1-3。

1.4 分子標記檢測

用于檢測與抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的分子標記均為共顯性SCAR標記，分別為P6-6、T0302、P6-25[11-13]；所有引物由上海英駿生物技術公司合成，引物序列見表1。PCR反應體系：模板1.5 μL，Taq PCR Master Mix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2.5 μL；反應程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，退火53 ℃[57 ℃（T0302）]30 s，72 ℃ 45 s ，35個循環，72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 園藝性狀指標調查

評價材料遺傳背景的主要農藝性狀包括：下胚軸顏色、生長習性、莖葉茸毛、葉片類型、葉片形狀、葉色、葉裂刻、花序類型、花柱長度、花柱形狀、花色、花梗離層、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、果面茸毛、果頂形狀、果肩、商品果果形指數、果形、果肉顏色、胎座膠狀物質顏色、心室數、可溶性固形物含量、單果質量、種子千粒重。其中，莖葉性狀指標在第3穗果成熟期調查統計，花序性狀指標在第2花序盛開期調查，果實性狀指標在第2穗果成熟期進行調查，各指標采用5個果實的平均值；利用糖度計測量果實的可溶性固形物含量。

1.6 數據分析

利用Microsoft Excel 2010及SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同材料田間煙粉虱接種鑒定后的抗病性表現

單個不同抗病基因及不同抗病基因聚合植株的病級統計結果見表2，定植30 d后進行病情調查，只有感病材料‘TMX255-1‘TMX255-5和對照材料出現病癥，單基因抗源材料除了‘TY52（只含有Ty-1）有輕微感病癥狀外，其余單基因抗源材料和聚合基因材料都無發病癥狀。定植60 d后，感病材料‘TMX255-1‘TMX255-5和對照材料均表現為嚴重感病，植株生長停滯，葉片嚴重黃化卷縮；單基因抗源材料‘TY52表現輕微感病，新葉表面輕微黃化，無皺縮；其余材料均無明顯感病癥狀，均表現為高抗。結合苗期接種鑒定與分子標記檢測，選擇表現高抗且分別含有抗病基因組合Ty-1和Ty-2，Ty-1和Ty-3的聚合單株自交留種，再自交，獲得2份聚合材料。獲得的2份聚合株系整個生育期都表現高抗TYLCV，且農藝性狀穩定一致，可以作為自交系用于育種工作。

2.2 聚合后代主要農藝性狀觀察

通過田間農藝性狀統計調查，結果顯示聚合自交系‘TY1-2和‘TY1-3在葉、花、果等農藝性狀方面與受體親本已無顯著差異（表3）。

2.3 分子標記鑒定聚合材料抗性基因

利用與抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3連鎖的分子標記P6-6、T0302、P6-25篩選‘TY1-2‘TY1-3的聚合單株，其中含有Ty-1和Ty-2的‘TY1-2聚合單株能擴增出530 bp和900 bp的特異片段，含有Ty-1和Ty-3的‘TY1-3聚合單株能擴增出530 bp和450 bp的特異片段。從‘TY1-2的148個單株中隨機抽取7株進行抗病基因Ty-1（圖1-A）和Ty-2（圖1-B）的分子標記檢測。從‘TY1-3的92個單株中隨機抽取7株進行抗病基因Ty-1（圖1-C）和Ty-3（圖1-D）的分子標記檢測。結果顯示，抽取的單株中均分別含有Ty-1和Ty-2、Ty-1和Ty-3抗病基因。

3 討 論

3.1 抗性基因聚合對后代抗病性的影響

通過對含有不同單個抗病基因的材料和2份聚合材料‘TY1-2‘TY1-3進行田間TYLCV接種鑒定，結果表明，聚合了多個抗病基因的材料抗病性顯著強于只含有單個抗病基因的材料，同時也證實P6-6、T0302、P6-25分子標記輔助選擇聚合育種的有效性。

3.2 分子標記在聚合育種中的作用

用傳統的育種方法要實現將多個抗性基因聚合在一起是相當困難的，不僅費時費工，而且很難對多個抗性基因進行檢測和鑒定。采用分子標記輔助選擇技術對目標基因直接選擇，可以很大程度上減少選擇的盲目性，提高育種效率，加快育種進程。

本研究中應用的3個分子標記，P6-6、T0302和P6-25，在應用過程中，擴增條帶穩定，但遺傳距離較大，在后代選擇過程中，P6-6的準確率為84.5%，T0302的準確率為89.8%，P6-25的準確率為83.2%。所以分子標記輔助選擇必須與田間抗性鑒定相結合，才能達到預期目標，不能單純依靠分子標記進行篩選。此外，還需要繼續開發新的更加緊密連鎖的分子標記，以期進一步提高分子標記選擇的準確率。

3.3 回交后代的選擇

關于回交后代選擇的評價指標主要有性狀指標和分子標記檢測指標[14]。筆者選用綜合性狀優良的番茄自交系‘TMX255-1和‘TMX255-5作為抗性基因受體親本，先分別單向回交6代，同時每一代都應用分子標記對目標基因進行選擇，使回交后代的遺傳背景恢復至近于輪回親本，且同時含有相應抗病基因。當遺傳背景得到一定程度恢復后，再將2個方向的回交后代雜交，從聚合雜交后代中獲得遺傳背景近于輪回親本的抗病植株。在定向轉移抗病基因Ty-1、Ty-2時，其供體親本‘TY52‘CLN2777A與受體親本‘TMX255-1和‘TMX255-5間的遺傳背景差異較大，回交后代性狀向輪回親本恢復的速度相對較慢，其BC6 世代綜合性狀與輪回親本仍有一定差異。下一步計劃篩選出多態性好的分子標記，應用于回交后代性狀的恢復過程中，一定程度上提高回交后代的遺傳背景恢復速率。

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