何首烏中二苯乙烯苷類物質的分離純化及抗氧化活性研究

李敏，敬小莉，談文林

（1.達州職業技術學院，四川達州 635000；2.四川文理學院 化學化工學院，四川達州 635000）

何首烏作為傳統的大宗中藥材，具有極高的藥用價值。其根部入藥，具有活絡、養血、安神、消癰、解毒（截瘧）等功效[1-3]。研究發現，何首烏中主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類和黃酮類等具有生物活性和藥理作用的化合物[4-5]。二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）是何首烏的主要藥效成分，具有抗氧化、抗衰老、抗老年癡呆、保肝護肝、增強免疫力、降低膽固醇和防止動脈硬化等藥理作用[6-7]，其含量作為何首烏及其制劑的質量評價指標[8]。目前，對何首烏中二苯乙烯苷類物質的研究主要集中在提取方法及提取物的活性研究方面，對于何首烏中二苯乙烯苷的分離純化及其抗氧化活性方面研究較少。因此發展一種能將提取液進行分離純化，并將純化產物用于有針對性的抗氧化活性研究具有十分重要的現實意義。

大孔吸附樹脂是近幾年發展起來的一種具有高效吸附性能的有機聚合物吸附劑，具有化學性能穩定、選擇性高、再生簡單和高效節能等優點，廣泛應用于天然產物的分離純化工藝[9-10]。本文以四川達州產何首烏為研究對象，通過超聲波輔助提取技術提取何首烏中二苯乙烯苷類物質，采用大孔吸附樹脂對二苯乙烯苷類物質進行分離純化，并對大孔吸附樹脂進行了篩選，為二苯乙烯苷類物質的工業化生產提供技術依據。將分離純化產物進行抗氧化活性研究，檢測何首烏中二苯乙烯苷類物質對·OH和DPPH·的清除能力，以及還原力測定，為深入開發利用四川達州產何首烏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

何首烏（40 ℃條件下干燥后粉碎過60目篩）：四川達州產；二苯乙烯苷標準品：中國標準物質中心；S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130型大孔吸附樹脂：上海源葉生物科技有限公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）：美國Sigma公司；六氰合鐵酸鉀（K3[Fe(CN)6]）、抗壞血酸（Vc）、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4）：國藥集團；其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）、SHZD3000型多功能全自動振蕩儀（上海電氣有限公司）、DZX-6022B真空干燥箱（上海福瑪實驗設備有限公司）、RE-2000B旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、FS-900N超聲波中藥提取儀（上海科祁儀器設備有限公司）、FA1004N電子分析天平（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

準確稱取二苯乙烯苷標準品5.0 mg，用無水乙醇溶解后定容至25 mL，即得200 mg/L二苯乙烯苷標準品溶液。分別精密吸取200 mg/L二苯乙烯苷標準品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和3.5 mL置于8個25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，分別測定不同濃度在322 nm下的吸光度，測定3次取平均值，以吸光度A（Abs）為縱坐標，二苯乙烯苷濃度C（mg/L）為橫坐標作圖，得二苯乙烯苷標準曲線，如圖1所示。線性回歸方程y=0.0567x+0.0083，相關系數R為0.9999，通過測定樣品溶液的吸光度，以此標準曲線方程計算樣品溶液中二苯乙烯苷類物質的含量（mg/L）。

圖1 二苯乙烯苷標準曲線

1.3.2 樣品中二苯乙烯苷類物質的提取、測定及上柱液的制備

二苯乙烯苷類物質的提取及測定根據文獻[11]方法改進，稱50.0 g的何首烏粉末，以體積分數60%的乙醇作溶劑，料液比為1∶25（g∶mL），采用800 W超聲提取，在65 ℃下提取1.5 h，重復2～3次，將提取液過濾，即得待測液。由于1.3.1中二苯乙烯苷標準品在322 nm波長下有特征吸收峰，因此取適量待測溶液于322 nm下測定吸光度，根據二苯乙烯苷標準曲線方程得到二苯乙烯苷類物質的濃度（C），按公式（1）計算苯乙烯苷類物質提取率為7.83%。將提取液減壓濃縮，蒸干得二苯乙烯苷粗提物，根據1.3.1中方法對二苯乙烯苷的純度進行測定，粗提物二苯乙烯苷類物質純度為34.62%，將粗提物用適量無水乙醇溶解，即得上柱液。

其中：C表示二苯乙烯苷類物質的濃度，g/mL；V表示樣品的體積，mL；M表示何首烏質量，g。

喬治·華盛頓大學兒童心理學教授葛林斯班認為：“感情能力不只是未來發展親密關系與依賴的基石，也是智能與許多認知能力的基礎。在孩子不同的發展時期，感情能力都扮演主導的角色，學習與認知技巧則跟隨其后。即使是數學能力，表面看來是與個人無關，是絕對屬于認知技巧的領域，其實也是透過感情來學習。例如：‘很多’對一個2歲的孩子而言，指的是超乎他所預期的；‘很少’是指比他想要的還少。”

1.3.3 大孔吸附樹脂預處理與再生

將市售大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，用適量乙醇洗至流出液與蒸餾水1∶5混合無渾濁現象，再用5%的鹽酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%的氫氧化鈉溶液浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附樹脂完成預處理。實驗使用過的大孔吸附樹脂，先用5%鹽酸浸泡2～4 h，用水洗至中性，最后用5%氫氧化鈉浸泡2～4 h，用水洗至中性，大孔吸附樹脂即可再次使用。

1.3.4 大孔吸附樹脂吸附-解吸實驗

準確稱取5.0 g預處理過的干大孔吸附樹脂，裝入錐形瓶中，加入已知濃度的何首烏二苯乙烯苷提取液50 mL，以120次/min的速度在室溫下振蕩48 h，大孔吸附樹脂充分吸附二苯乙烯苷后，取上層清液測定二苯乙烯苷類物質的濃度，按公式（2）、（3）計算大孔吸附樹脂對二苯乙烯苷類物質的吸附量（Q1）和吸附率（E）[12]。

其中：Q1表示吸附量，mg/g；C0表示溶液初始濃度，mg/mL；C1表示完成吸附后溶液濃度，mg/mL；E表示吸附率；M表示大孔吸附樹脂的質量，g。

將吸附飽和后的干大孔吸附樹脂加入50 mL無水乙醇，以120次/min的速度在室溫下振蕩48 h，大孔吸附樹脂充分解吸二苯乙烯苷后，取上層清液測定二苯乙烯苷類物質的濃度，按公式（4）、(4)計算大孔吸附樹脂對二苯乙烯苷類物質的解吸量（Q2）和解吸率（D）[13]。

其中Q2表示解吸量，mg/g；C2表示解吸液濃度，mg/mL；D表示解吸率。

1.3.5 二苯乙烯苷類物質的分離純化

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 清除羥基自由基（·OH）活性測定

采用Fenton反應[14-15]，分別取純化二苯乙烯苷和Vc進行實驗，在10 mL比色管中分別加入不同濃度（見圖3）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液1 mL，6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和0.1%的H2O2溶液1 mL，搖勻后靜置5 min，然后加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，用蒸餾水定容，搖勻后在37 ℃水浴30 min，離心后在510 nm處測定其吸光度為A2，再將樣品（純化二苯乙烯苷和Vc）用1 mL的蒸餾水代替，測定其吸光度為A0，將體系中H2O2溶液用1 mL蒸餾水代替，測定其吸光度為A1，按公式（6）計算純化二苯乙烯苷和Vc對·OH的清除率。

其中：E表示清除率；A0表示未加樣品的吸光度；A1表示未加雙氧水的吸光度；A2表示加入樣品的吸光度。

1.3.6.2 清除DPPH·活性測定

分別取純化二苯乙烯苷和Vc進行實驗，在10 mL比色管中分別加入不同濃度（見圖4）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2 mL和0.2 mmol/L的DPPH·乙醇溶液2 mL，用無水乙醇定容后搖勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度為A2，再將樣品（純化二苯乙烯苷和Vc）用2 mL無水乙醇代替，測定其吸光度為A0，將體系中DPPH·乙醇溶液用2 mL無水乙醇代替，測定其吸光度為A1，按1.3.6.1方法計算純化二苯乙烯苷和Vc對DPPH·的清除率。

1.3.6.3 還原力測定

分別取純化二苯乙烯苷和Vc進行實驗，在25 mL容量瓶中分別加入不同濃度（見圖5）的純化二苯乙烯苷和Vc乙醇溶液2.5 mL，1.0%六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）2.5 mL，搖勻后50 ℃水浴20 min，冷卻后加入10%醋酸2.5 mL和0.1%氯化鐵溶液2.5 mL，用蒸餾水定容，搖勻后靜置10 min，離心后在700 nm處測定其吸光度，在相同濃度條件下，純化二苯乙烯苷和Vc比較，吸光度越大，其還原力越強。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

依據1.3.4方法，將大孔吸附樹脂S-8、NKA-9、D101、D201、D301、AB-8、DM-130用于何首烏中二苯乙烯苷類物質的靜態吸附-解吸實驗，實驗結果見表1。從實驗數據可知，不同種類樹脂的吸附率和解吸率不同。從吸附率的數據可以看出，NKA-9樹脂吸附率最高；從解吸率的數據可以看出，S-8樹脂解吸率最高，NKA-9樹脂次之，但兩者差別不大。從表1中數據綜合考慮吸附-解吸效果，NKA-9樹脂效果最好，因此選擇NKA-9樹脂對何首烏中二苯乙烯苷類物質進行分離純化。

表1 吸附-解吸實驗結果

2.2 NKA-9大孔樹脂吸附實驗

在單因素實驗的基礎上，以二苯乙烯苷上樣液濃度（A）、上樣速度（B）、上樣量（C）和乙醇濃度（D）四因素為變量，進行L9(34)正交試驗，方案設計見表2所示。

表2 因素水平表

以NKA-9大孔樹脂對二苯乙烯苷的吸附率為評價指標，對上樣液濃度（A）、上樣速度（B）、上樣量（C）和乙醇濃度（D）進行正交實驗優化，實驗結果見表3。

表3 正交實驗結果

從表3的極差分析可知，樹脂吸附效果的影響大小順序為：A＞C＞B＞D，即二苯乙烯苷上樣液濃度（A）對吸附率影響最大，其次是上樣量（C）和上樣速度（B），最后是乙醇濃度（D）。由k值得出NKA-9大孔樹脂對二苯乙烯苷的最佳吸附條件為：A2B2C2D1，即上樣液濃度為3.5 mg/mL、上樣速度為3.0 BV/h、上樣量為3.0 BV和乙醇濃度70%。

2.3 NKA-9大孔樹脂解吸實驗

在二苯乙烯苷解吸過程中，首先用石油醚和乙酸乙酯混合液（體積比2∶1）洗脫，除掉二苯乙烯苷粗提物中的極性較小的揮發油、脂類和色素等，再用無水乙醇以流速3.0 BV/h洗脫，TLC監測，按BV收集洗脫液，按1.3.1方法測定各段洗脫液二苯乙烯苷的含量（mg/mL），得到解析曲線，實驗結果圖2所示。

由圖2可知，在收集的各段洗脫液中，隨著洗脫液體積的增加，二苯乙烯苷的含量先增加再降低，到第4BV洗脫液時，二苯乙烯苷已基本洗脫完全，因此可以確定選用洗脫液用量為4BV進行解吸。

圖2 大孔樹脂解吸曲線

2.4 清除羥基自由基（·OH）作用

以純化二苯乙烯苷和Vc對羥基自由基（·OH）的清除作用比較，設計對比實驗，其實驗結果如圖3所示。

圖3 二苯乙烯苷和Vc對·OH的清除能力

由圖3可知，在所選實驗質量濃度范圍內，純化二苯乙烯苷和Vc隨著濃度的增加，清除羥基自由基（·OH）的能力不斷增強，當濃度達到一定值時，清除率趨于穩定。其中純化二苯乙烯苷濃度為35 mg/L時，純化二苯乙烯苷對·OH的清除率達到72.72%，說明純化二苯乙烯苷對羥基自由基（·OH）有較好的清除能力。

2.5 清除DPPH·作用

以純化二苯乙烯苷和Vc對DPPH·的清除作用比較，設計對比實驗，其實驗結果如圖4所示。

由圖4可知，在所選實驗質量濃度范圍內，純化二苯乙烯苷和Vc隨著濃度的增加，清除DPPH·的能力不斷增強，當濃度達到一定值時，清除率趨于穩定。其中純化二苯乙烯苷濃度為14 mg/L時，純化二苯乙烯苷對DPPH·的清除率達到78.73%，結果表明，純化二苯乙烯苷對DPPH·有較好的清除能力。

圖4 二苯乙烯苷和Vc對DPPH·的清除能力

2.6 還原力分析

一般而言，物質的還原力與抗氧化能力之間具有相關性，物質的抗氧化能力越強，還原力越強。以純化二苯乙烯苷和Vc對Fe3+的還原力比較，設計對比實驗，其實驗結果如圖5所示。

圖5 二苯乙烯苷和Vc的還原力

還原力測試實驗是根據Fe3+被還原為Fe2+，純化二苯乙烯苷和Vc還原六氰合鐵酸鉀后，生成普魯士藍，在700 nm處出現最大吸收。由圖5可知，在所選實驗質量濃度范圍內，純化二苯乙烯苷和Vc的還原力隨著濃度的增加而增大，在相同濃度條件下，純化二苯乙烯苷的還原力約為Vc的40%，雖然純化二苯乙烯苷的吸光度值低于Vc，但純化二苯乙烯苷也表現出了較強的還原力。

3 結論

本實驗通過超聲波提取技術，從何首烏中提取得到了二苯乙烯苷類物質，提取率為7.83%，粗提物二苯乙烯苷類物質純度為34.62%。通過對大孔吸附樹脂的吸附-解吸實驗考察，篩選出了效果最佳的NKA-9樹脂；采用石油醚、乙酸乙酯和無水乙醇對何首烏二苯乙烯苷類物質粗提物進行梯度洗脫，TLC監測，制備得到純化二苯乙烯苷類化合物，純度為72.68%。通過純化二苯乙烯苷類化合物與Vc抗氧化活性和還原力比較研究，二苯乙烯苷類物質對·OH和DPPH·的清除率分別達到72.72%和78.73%，還原力約為同濃度Vc的40%，實驗結果表明，何首烏中二苯乙烯苷類物質具有較好的抗氧化活性和較強的還原能力。