轉氨酶高效表達重組工程菌的培養基及誘導條件優化

葉質強，馮露，王心潔，鄂松

（湖北省宏源藥業科技股份有限公司，湖北黃岡 438600）

轉氨酶是可催化氨基酸與酮酸之間氨基轉移的一類酶，普遍存在于動植物組織和微生物中作為生物催化劑可用于制備手性胺類化合物，其催化效率高、選擇性強，相比較化學合成方法具有反應條件溫和、轉化率高、立體結構專一、成本低等優勢。酶催化方法制備手性化合物是目前不對稱合成領域重要的研究方向[4]。

西格列汀是由美國Merck公司開發生產用于治療Ⅱ型糖尿病的DPP-Ⅳ抑制劑類藥物。由于傳統化學合成方法條件苛刻，產率較低，導致成本較高，Merck公司通過和Codexis公司合作開發了一種新型生物催化劑——轉氨酶，使用該酶催化200 g/L濃度底物24h轉化率達92%，ee值大于99.5%。該方法路線（圖1）將轉化率提高了13%，同時減少了19%的廢物[6]，因此法獲得了2010年美國總統綠色化學挑戰獎，也為藥物的手性合成提供了新方向。

本實驗中使用的是一種來自網絡節桿菌（Arthrobacter sp. KNK168）菌野生型（R）-選擇性轉氨酶克隆基因，通過構建表達質粒PE-ATS在大腸桿菌BL21（ED3）中重組突變得到的菌株，可用于表達轉氨酶催化底物轉化西格列汀。為提高酶的表達活性，采用單因素和正交實驗來優化菌株培養基組成，并對酶的誘導條件進行優化，獲得可高效表達轉氨酶的培養基和誘導條件，為后期放大試驗提供了參考和依據。

圖1 酶催化合成西格列汀路線

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

E.coli Bl21

1.1.2 試劑

胰蛋白胨（以下統稱蛋白胨）和酵母浸粉（以下統稱酵母粉），安琪酵母公司；蔗糖，阿拉丁試劑；誘導劑（IPTG），賽默飛；氨芐青霉素，Borship；底物（CAS：764667-65-4）、西格列汀標準樣，Sigma；其它原料均為國藥分析純試劑。

1.1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，氨芐1‰。

發酵培養基：葡萄糖5.0 g/L、酵母粉10.0 g/L、氯化鈉2.0 g/L、磷酸氫二鉀3.0 g/L、磷酸二氫鈉1.0 g/L、氨芐1‰。

1.1.4 儀器設備

SX-700蒸汽滅菌鍋（日本TOMY）；TGL-20MS離心機（湘儀）；Scientz-ⅡD超聲波細胞粉碎機（寧波新芝）；C-MAG HS 10 digital攪拌器（IKA）；HZQ-311C搖床（上海一恒）；L5/UV759紫外分光光度計（上海精密）；垂直型槽電泳儀（北京君意）；ME104分析天平（梅特勒）；高效液相色譜儀（安捷倫1260）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

工程菌保存：將菌種劃線于LB（Amp）固體培養基上，37 ℃恒溫箱培養24 h，挑取單菌落接種于LB（Amp）液體培養基中，培養至對數生長期按1 ：1比例加入30%甘油水溶液，分裝100 μL/管，放置-80 ℃保存。

菌種活化：從冰箱中取1支菌種，快速融化，按1%量接種于含LB培養基的試管中，加入1‰的氨芐青霉素，置于37 ℃搖床中，210 r/min培養12 h。

1.2.2 發酵條件

培養基裝液量為搖瓶體積的1/5，加入1‰氨芐青霉素，接種量2%，溫度37 ℃，搖床180 r/min，培養4 h，加入0.5 mmol/L IPTG誘導培養5 h。

1.2.3 菌體濃度（OD600）測定

發酵液適當稀釋后，在分光光度計600 nm波長處測定吸收值（要求每次讀數≤0.8），每個樣測量3次，取平均值作為結果，然后乘以稀釋倍數即為發酵液OD600值。

1.2.4 表達量檢測

SDS-PAGE檢測酶的表達情況：配制12%分離膠+5%濃縮膠，取1 mL發酵液離心收集菌體，加入上樣緩沖液100 μL，開水煮沸，置于冰上10 min，取上清10 μL上樣，80 V電泳過濃縮膠，換110 V至結束。考馬斯亮藍染色2 h，甲醇-醋酸混合液脫色過夜。

1.2.5 酶活性測定

將發酵液離心得到菌絲體，加入緩沖液充分混勻并用超聲波破碎，催化一定濃度的底物轉化為西格列汀，使用高效液相色譜（HPLC）檢測生成物峰面積（圖2），與標準樣品濃度峰面積對比并計算出底物單位時間轉化量，得出酶活性。以西格列汀標準樣品溶液濃度為橫坐標（X），色譜峰面積（測3次取平均值）為縱坐標（Y）作標準曲線（圖3）。酶活定義：按照酶活性試驗與檢測方法，1 min 催化1μmol底物轉化為西格列汀所需的酶量為一個活力單位(U)。

酶活性試驗與檢測方法 取1 mL發酵液離心，去掉上清，加入等體積PBS，超聲破碎30 s再分別加入45% DMSO、10 g/L底物、2.0 mol/L異丙胺鹽、1 mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），異丙胺調節pH值為8.5，反應總體積為3 mL，在45 ℃下反應30 min后立即取出，快速加入等量乙腈充分混勻，離心，取上清液微濾稀釋后通過HPLC檢測。條件為：安捷倫1260機型，SB-C18/ 4.6×150 mm/5μm色譜柱，流動相為0.1%磷酸-水溶液/乙腈，檢測波長267 nm，進樣量10 μL，流速 1 mL/min。

圖2 西格列汀與底物HPLC圖

圖3 西格列汀濃度與峰面積標準曲線

1.2.6 培養基優化

以發酵液OD600為指標，考察碳源、氮源和無機鹽對其影響。單因素實驗分別選用葡萄糖、甘油、蔗糖作為碳源，濃度為3、6、9、12、15 g/L和18 g/L；蛋白胨、酵母粉、玉米作為氮源，濃度為4、8、12、16、20 g/L和24 g/L；正交實驗選用硫酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉4種無機鹽確定最優配比，條件見表1。

表1 無機鹽濃度正交實驗因素與水平 （單位g/L）

1.2.7 發酵誘導條件優化

以酶活性和表達量作為考察指標，通過單因素實驗分別選取不同誘導溫度分別為28、30、32、34、36、38、40 ℃，誘導時間分別為 2、4、6、8、10、12h，誘導劑濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。以上培養條件均同實驗方法（2.2.2），每次實驗得出最優結果將置換下一次實驗其他同因素。

2 結果與分析

2.1 不同碳源及其濃度選擇

碳源是組成細胞成分的碳架，為細胞生長代謝提供能源，常見的碳源有甘油、葡萄糖，蔗糖、可溶性淀粉等[8]。由圖4可知：甘油從3 g/L增加到6 g/L時菌生長速率最快，到9 g/L時OD達到最高，繼續增加濃度呈下降趨勢；隨著葡萄糖濃度增加OD600快速增長，當濃度大于9 g/L后增長緩慢；蔗糖濃度對菌密度影響趨勢與葡萄糖相似，但低于葡萄糖。綜合分析，選用甘油作為培養基碳源，濃度為9 g/L。

圖4 不同碳源及其濃度對菌密度影響

2.2 不同氮源及其濃度選擇

氮源作為細胞蛋白質和代謝產物合成的重要營養物質，一般可分為有機氮和無機氮兩大類，常見有機氮源有蛋白胨、酵母粉、玉米漿等，無機氮源主要有硝酸鹽和銨鹽類。實驗室常用有機氮源，可為菌提供豐富的蛋白質、多肽及不同的微量元素和生長因子，有利于蛋白質的合成與表達。由圖5可知，酵母粉作氮源，當其濃度在16 g/L時增長速度和OD600最高；使用蛋白胨濃度增長速度變緩；玉米粉作氮源菌密度相對偏低。因此選用酵母粉作為氮源，濃度為16 g/L。

2.3 不同濃度無機鹽配比對菌生長影響。

無機鹽是微生物生長和代謝不可缺少的營養物質，是構成細胞的組織成分，具有維持酶的活性、調節滲透壓等作用[7]。正交實驗結果顯示，硫酸銨對菌體生長影響最為顯著，氯化鈉影響作用最小。影響主次硫酸銨＞磷酸氫二鈉＞磷酸二氫鉀＞氯化鈉；最優配比組合A2D2C3B2，依次濃度為硫酸銨4.0 g/L、磷酸氫二鈉2.0 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉6.0 g/L，見表2、表3。

圖5 不同氮源及其濃度對菌密度影響

表2 無機鹽配比優化結果與分析

表3 正交實驗結果方差分析

2.4 不同溫度下誘導結果

由圖6、圖7可知，酶活性和表達量隨著誘導溫度的上升而增加，在36 ℃活性達到最大；繼續升溫，出現較多雜蛋白，酶活性也快速降低，溫度過高和過低都不利于酶的表達。因此，在36 ℃條件下誘導最適宜。

圖6 不同誘導溫度對酶活性影響

圖7 不同誘導溫度對酶表達量影響 （28-40℃）

2.5 不同誘導時間結果

由圖8、圖9得知，酶活性在誘導4 h后最大，隨著時間的增加，包涵體濃度增加，酶活性有所下降。因此，選擇誘導時長為4 h。

圖8 不同誘導時間對酶活性影響

圖9 不同誘導時間對酶表達量影響

2.6 不同誘導劑濃度下誘導結果

由圖10、圖11可知，在誘導劑濃度為0.8 mmol/L時，酶表達量最高，活性最高。濃度從0增加到0.6 mmol/L，酶活性也快速增加，濃度從0.6增加至0.8時，酶活性增量不明顯，繼續增加誘導劑濃度對酶活性沒有明顯影響。因此從經濟角度考慮，選擇0.6 mmol/L濃度適宜。

圖10 不同濃度誘導劑對酶活性影響

圖11 不同濃度誘導劑對酶表達量影響

3 結論

從實驗可以看出，甘油作碳源更適合菌的生長，可能相對于葡萄糖不容易產酸、乙醇等有害代謝物；使用蛋白胨作為氮源菌生長更快一些，最后隨著濃度的增加兩者OD值基本達到一致，發酵過程中多采用二者搭配使用來促進菌體更高密度的增長；添加無機鹽對菌的生長代謝有促進作用，其中硫酸銨對菌密度影響最大，可能是氮元素的增加促進了菌的生長；誘導條件作為影響酶表達和活性關鍵因素，通過SDSPAGE分析酶表達量和HPLC測定酶催化活性發現二者變化趨勢基本一致，說明表達量與酶活性呈一定的線性關系。實驗最終確定培養基條件為葡萄糖9 g/L、蛋白胨16 g/L、硫酸銨4.0 g/L、磷酸氫二鈉2.0 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉6.0 g/L；最佳誘導條件為37 ℃下加入0.6 mmol/L誘導劑（IPTG）誘導4 h結束發酵。通過驗證使用以上條件下培養最終得到的菌OD600可達到6.63，轉氨酶可溶表達量約占可溶蛋白總量的50%，轉氨酶活性可達758 U/L。