響應面法優化超聲輔助提取桔梗多糖工藝

劉佳，郭少林，陳婷婷，張繼業，范清玉

（西安培華學院，陜西西安 710125）

商洛地理位置優越，處于秦嶺南麓，因此有著豐富的天然藥材，也被譽為天然藥庫。其中桔梗作為多年生的草本植物，是當地主要的藥材類型，藥效價值較高，并且有一定的營養價值，在心腦血管預防及宣肺止咳方面療效明顯，市場銷售理想。此外商洛地區的桔梗可以食療，通過研究其化學成分，我們認為其根莖中蘊含著豐富的多糖苷，也就是百姓俗稱的桔梗皂苷。此外還含有豐富的多糖，維生素，氨基酸等物質。當前對于其多糖成分的研究還不夠深入，更多的是其藥理活性價值的分析，臨床上認為其可以抗疲勞，降血糖，而接下來對其多糖的工藝制備研究還不夠系統與完善，這也是我們后期借助超聲輔助技術提取多糖的主導思路。事實驗證其成效十分明顯，既能大幅縮短提取時間，也能確保多糖的得率。而本文主要以液料比、超聲時間、超聲溫度作為試驗因素，基于響應面法探討超聲輔助技術支持下的桔梗多糖提取工藝，以期獲得桔梗多糖得率最大限度的提升，推動當地經濟發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔梗藥材，采自陜西省商洛市，為3年生桔梗的干燥根莖。

755B紫外光光度計、BILON-1000CT超聲波提取器、工業用電子天平、冷凍干燥機、TGL-20bR的高速冷凍離心機、RE-3000B的旋轉蒸發儀。

1.2 試驗過程

1.2.1 桔梗多糖的制備及含量測定。

獲取桔梗根莖，進行初步的粉碎處理，進行石油醚脫脂，進行超聲輔助熱水回流提取，進行離心處理，獲得上清液，液體濃縮，進行乙醇沉淀，進行離心沉淀，采用Sevage法除蛋白透析后進行真空冷凍干燥處理，最終獲得桔梗多糖。采用苯酚-硫酸法進行多糖含量的測量，具體的測量公式為M粗多糖/M桔梗粉末×100%

1.2.2 試驗單因素分析

在桔梗多糖制備過程中進行單因素的試驗分析。分別選擇液料比為20∶1、超聲時間40 min、超聲溫度80℃、超聲功率150 W，這些都是試驗對照指標，而對應的單因素試驗指標為：液料比（10∶1，20∶1，30∶1，60∶1）、超聲時間（20、40、60min）、超聲溫度（40、60、80℃）、超聲功率（75、100、125、150W），探討單因素對桔梗多糖得率的影響。單因素試驗分析時，其他因素選擇的是固定水平，起到實驗對照的積極作用。其中桔梗多糖得率為主要的試驗指標，據此繪制單因素曲線圖，進行單一因素對其得率的具體影響的試驗分析。

1.2.3 響應面優化桔梗多糖提取

綜合考慮到單因素的試驗結果，對液料比，超聲時間，超聲溫度及超聲功率等進行自變量的分析，參考Box-Behnken響應面設計，以桔梗多糖得率作為響應值，分別開展四大因素的響應面試驗，借助通用的Design Expert8.06軟件進行試驗結果的分析。

1.3 數據處理及統計分析

此次試驗無論是方案的設計與部署還是模型的建構都使用的Design Expert8.06軟件，采用Excel 2016進行收集到數據的處理，采用SPSS18.0軟件中的單因素ANOVA進行數據因素的統計分析。

2 結果與分析

2.1 桔梗多糖提取物總糖含量測定結果

基于苯酚-硫酸法測定總糖含量，繪制曲線，如圖1所示。標準曲線線性關系中對應的R2數值為0.9965，對應的總糖含量為87.51%。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 PGPs制備工藝單因素試驗結果

由圖2可知，超聲溫度、超聲時間、超聲功率、液料比四個因素對桔梗多糖得糖率有明顯影響，液料比對桔梗得糖率的影響是呈線性增長的，達到一定程度后趨于平緩。常規情況下，在液料比25∶1時會達到峰值，之后開始緩慢下降。而超聲時間對其得糖率的影響屬于正態分布模式，呈現先增加后減少的趨勢。常規情況下20分鐘時達到頂峰。超聲溫度與桔梗得糖率也是正相關的關系，隨著超聲溫度的提升，桔梗的得糖率明顯提升，一般認為70℃為得糖率最高的溫度。在這之后逐步下降。最后超聲功率對桔梗得糖率也有一定影響，其與超聲溫度的影響一致，是正相關關系，呈現先增加后減少的趨勢。

圖2 試驗因素對桔梗多糖得率的影響

2.3 PGPs提取工藝優化結果

2.3.1 Box-Behnken設計與試驗結果

在單因素分析的基礎之上進行綜合因素的影響分析，主要是開展液料比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率與PGPs得率之間的水平響應面試驗。基Box-Behnken試驗設計原理，輔助Design Expert 8.06試驗設計軟件和 SPSS 統計軟件對綜合因素影響結果進行分析，得到桔梗多糖得率（Y）對液料比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）和超聲功率（D）的四元二次回歸方程：

Y=7.907+0.587A+0.165B+0.072C-0.084D-0.141AB-0.202AC-0.054AD+0.084BC+0.053BD+0.214CD-0.380A2-0.082B2-0.261C2-0.219D2

從方程結果看，液料比的影響性大于超聲時間，而超聲時間大于超聲功率，而超聲功率大于超聲溫度；基于二次項看，液料比、超聲溫度、超聲功率、超聲時間依次減弱。

2.3.2 響應面分析

數據擬合后得出回歸方程，進行各因素響應曲線的繪制。其中交互作用顯著與否受實驗因素影響明顯，如果響應曲面中曲線走勢明顯則意味著該因素對桔梗得糖率影響增大。如果曲線平緩則影響小。最終結果顯示：液料比的影響最大，其次是超聲功率和溫度，最后是超聲時間。

2.4 最佳工藝參數優化及驗證試驗

進行Box-Behnken設計工藝優化處理，對應的研究結論是：液料比21.35∶1，超聲時間19.53min，超聲溫度70.3 ℃，超聲功率151.53 W，綜合這些條件，PGPs得率可達最大值8.172%。此條件下重復5次，PGPs平均得率為8.108%（純度為87.43%）接近模型預測值，可以在桔梗多糖工業化生產實踐中得以運用與推廣。

3 結論

多次試驗結果表明：采用超聲輔助熱水浸提桔梗多糖最佳因素組合為：液料比為20∶1，超聲時間20min，超聲溫度70℃，超聲功率150W，這些條件綜合作用下，桔梗多糖率最高。各因素對桔梗多糖的影響呈現先增后減的趨勢。深入分析原因，一般認為桔梗為多年生的草本植物，其多糖成分屬于胞內多糖，提取時需要對植物細胞壁進行破除，利用超聲波的空化作用延長提取時間確保細胞壁破除率提升，確保多糖得糖率。這也不是絕對的，如果延長超聲時間無限制增加，則超聲波的空化作用對桔梗的多糖結構起到一定的破壞性，如果持續性的高溫也導致多糖得糖率達到頂峰后的急速下降，這些都有學者在試驗中進行了驗證與論述。