電紡SF/bFGF納米纖維膜用于皮膚缺損修復

魏琪，陳品澔，楊瀅，李佳妮

（西安培華學院 醫學院，陜西西安 710125）

皮膚是機體的第一道防線，當皮膚創傷、燒傷等后面臨著皮膚創面的修復，包括止血、消炎、細胞增殖和遷移等[1]，而傳統的生物敷料比如紗布僅僅保護傷口、暫時止血的作用，顯然已達不到社會的需求。近些年，研究者們往往在生物敷料中融合一些生長因子用于缺損修復[2]，bFGF在眾生長因子中研究相對比較深入。Shuichi Ogino等[3]將bFGF注入cgs（膠原蛋白/明膠海綿），植入小鼠背部的全厚皮膚缺陷，結果顯示促進了真皮樣組織的形成；Sakamoto等[4]利用1%的戊二醛交聯明膠與bFGF，并將交聯液作用于小鼠的缺損皮膚，結果表明交聯液有效地促進小鼠缺損皮膚的修復。在眾多敷料材料中，絲素蛋白作為天然結構蛋白，有利于細胞貼附和伸展，易提取且提取量大等優點在生物醫學領域備受青睞[5]。比如，Tony M. D等通過J將絲素蛋白與神經生長因子（Nerve growth factor,NGF）、睫狀神經生長因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）共紡形成納米纖維膜，卷曲形成3D支架，將大鼠的原代神經細胞種植其上，突起的長度明顯增長。可見，絲素蛋白材料可被設計并融合生長因子用于皮膚缺損的修復。2016年，筆者將ELP50-bFGF（類彈性蛋白ELP50與bFGF的融合蛋白）與絲素蛋白按比例凍干形成復合膜片用于小鼠皮膚缺損的修復，結果發現復合膜片中bFGF并未表現出活性，可能ELP50的結構影響了bFGF的結構使其失活。因此，本實驗擬改進方法通過靜電紡絲制備SF/bFGF納米纖維膜，以期促進皮膚缺損的修復。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡的昆明小鼠，由西安培華學院中心實驗室提供。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉（Sigma）、BCATM蛋白檢測試劑盒（Thermo）、胰酶（Hyclone）、DMEM（Gibco）、非必需氨基酸（Hyclone）、PBS（Hyclone）、胎牛血清（FBS,Gibco）、Na2S（天津天力），其他試劑均為分析純試劑。

1.3 儀器

冷凍式干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）、倒置顯微鏡（NikonBinder）、真空干燥箱（Vacucell 22L, MMM）、掃描電子顯微鏡（SEM，飛利浦）、超凈臺（海爾）等。

1.4 實驗方法

（1）絲素蛋白的制備。切割蠶繭，干燥并稱重10 g，置于含有2 L Na2CO3（濃度0.05 mol/L）水溶液的鍋中，脫膠30 min，蒸餾水多次洗滌，脫膠反復進行3次后在100 ℃烘箱中烘干，用9.3 mol/L LiBr在80℃水浴中溶解絲素蛋白，以轉速為10 000 r/min的速度離心10 min用于除去懸浮雜質，最后裝入透析袋透析3 d，凍干機凍干保存。

（2）SF/bFGF納米纖維膜的制備。將SF凍干品加入雙蒸水配成濃度為25%的溶液，加入bFGF，使bFGF的濃度為10 μg/mL，設置距接收屏的距離為7 cm及電壓為20 kV/cm，進行靜電紡絲獲得SF/bFGF納米纖維膜。

（3）遷移實驗。使用無菌的12孔板，用記號筆在每個孔背面均勻的畫線，向每個孔中各放入一個蓋玻片后各加入1 mL混合蛋白溶液（bFGF的濃度為10 μg/mL，SF的濃度為25%）進行包被。次日，向每個孔內各種5×105個L929細胞，等細胞長滿整個孔后用槍頭沿著記號筆的橫線劃痕，在0 d和3 d，借助顯微鏡觀察細胞的形態并觀察遷移的數量和距離。實驗過程中，各孔加入等量PBS組作為陰性對照組。

（4）昆明小鼠皮膚缺損修復實驗使用麻醉劑戊巴比妥鈉事先麻醉小鼠，脫毛劑脫毛后，在背部中央消毒部位制造直徑約1.2 cm的圓形缺損，將直徑也為1.2 cm的SF/bFGF納米纖維膜和SF膜各貼于昆明小鼠皮膚缺損部位，無貼附組即con組，每組包含6只小鼠，每天采照并計算傷口的愈合面積。

2 結果與分析

2.1 復合膜片的形態結構

SF和bFGF混合溶液靜電紡絲得到的纖維如圖1所示，設置濃度SF為25%，bFGF為10 μg/mL、距接收屏的距離為7 cm及電壓為20 kV/cm，纖維形貌比較均一和規則，粗細相對一致，可見少量串珠和液滴的存在。

圖1 靜電紡絲納米纖維膜形態

2.2 SF/bFGF對L929遷移能力的影響

L929遷移結果如圖2所示，0d時，L929剛好長滿各孔，長勢優良且形狀如長梭，劃痕區都可見少量L929；3 d時，SF/bFGF組比對照組有更多的L929從劃痕區外遷至劃痕區內且距離也較長，此時各孔L929長勢稍弱，細胞中央漸漸突起，導致形狀由長梭漸漸變成短梭。

圖2 劃痕區L929遷移觀察

3.3 小鼠皮膚缺損修復實驗結果

小鼠膚缺損的修復情況如圖3所示，實驗組將SF/bFGF納米纖維膜和SF膜貼于小鼠的缺損部位，Con組不做任何處理。從第0 d到第18 d各組小鼠都陸續在修復，但修復速度不同，0 d時，纖維膜都牢牢的貼于缺損部位無需外力作用且有效的阻擋了血液的滲出；從第6 d到第18 d明顯看出SF/bFGF組小鼠缺損面積減小的快，到第18 d幾乎修復完成，SF組和Con組未修復完成。

圖3 小鼠皮膚缺損修復的大體觀察

3 討論

SF與bFGF混紡獲得SF/bFGF納米纖維膜，結果顯示纖維間有黏連推測復合膜片結構穩定，力學性能較好，SF/bFGF納米纖維膜是一種相對較好的載體材料。L929的遷移實驗結果顯示，SF/bFGF組比對照組細胞遷移的數量明顯多且距離遠，說明將SF/bFGF包被于培養皿底能有效促進細胞的遷移且表現出了bFGF的活性。小鼠皮膚缺損修復實驗大體結果顯示，SF/bFGF和SF均能促進小鼠皮膚缺損修復，SF/bFGF尤為明顯，雖然Con組各小鼠到第6天的修復面積標準偏差較其他組大，不影響整體修復結果。整體結果說明通過靜電紡絲獲得的SF/bFGF納米纖維膜表現出了bFGF的天然活性，也說明以絲素蛋白作可作為bFGF的承載材料。