低溫脂肪酶菌株的誘變篩選及酶學特性研究

王興吉 賈仁潔 王克芬 劉文龍

摘要以本公司菌種保藏室的產脂肪酶黑曲霉菌株AG007作為出發菌株，通過常溫常壓等離子體（ARTP）誘變篩選得到突變株A45-72，其產脂肪酶的活力較AG007提高了86%。再對A45-72進行亞硝基胍（NTG）復合誘變，得到突變菌株GH-73，其搖瓶發酵酶活達到2 350 U/mL，較出發菌株AG007提高了1.2倍，將GH-73傳到第10代，其產酶較穩定。搖瓶中添加2.5%橄欖油作為誘導劑時，產酶能力達到2 875 U/mL。通過酶學特性研究發現，其最適作用溫度為30 ℃，且在0 ℃左右保留30%的活性，是一種低溫脂肪酶。

關鍵詞常溫常壓等離子體;亞硝基胍;復合誘變;低溫脂肪酶

中圖分類號S-3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

脂肪酶（Lipase， EC3.1.1.3）是一類具有特殊酯鍵的水解酶[1]，它能夠催化長鏈脂肪酸甘油酯的水解，也能夠催化該反應的逆反應，除此之外，許多微生物分泌的脂肪酶還能夠催化酯交換反應、酸解反應、醇解反應、氨解反應和酯化反應等[2-3]。

微生物脂肪酶是指能夠分解或合成高級脂肪酸及丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶。微生物脂肪酶種類較多，具有比動物脂肪酶更廣泛的溫度和pH作用范圍，便于工業化生產。目前，它是一種重要的工業用酶，主要應用于食品風味及香味的改進、油脂的水解、低等油脂的改性、皮革絹紡的脫脂、添加于化妝品及洗滌劑中等。特別是在有機合成工業及油脂化工行業中，酶催化的反應具有耗能低、條件溫和及成品質量高等優點，具有巨大的應用潛力。

目前，工業上應用的脂肪酶主要是高溫和中溫脂肪酶，酶的最適作用溫度一般在40 ℃左右或者更高，并且在0 ℃左右基本喪失活性[4-6]。低溫酶在較低溫度條件下仍然具有比較高的酶活，熱穩定性下降[7]，因而在食品、洗滌、環保等方面具有廣泛的應用。另外，低溫脂肪酶還具有熱不穩定性的特點，這對于某些工業性的生物催化來說是有益的，例如，在食品的加工過程中，能夠在溫度較低的條件下快速使酶失去活力，進而避免在酶的熱處理失活過程中對食品造成營養損失[8]。

低溫脂肪酶是指最適反應溫度在30 ℃左右，并且在0 ℃附近仍然具有一定催化活力的脂肪酶[9]。現在低溫脂肪酶產生菌大多數來自南北兩極和大洋底部等長期處于低溫的環境中[10]。盡管產脂肪酶的微生物容易發現，可是，尋找到適合工業生產的脂肪酶生產菌株及其發酵條件卻比較困難，而通過傳統的誘變篩選能很大程度上提高脂肪酶的產量，使許多脂肪酶實現工業化生產。以本公司菌種室保藏的黑曲霉菌株AG007作為出發菌株，采用ARTP和亞硝基胍復合誘變的手段，獲得了一株遺傳穩定性良好的高產脂肪酶菌株，并且對其酶學性質進行初步研究。

1材料與方法

1.1材料試驗菌株，黑曲霉AG007，本公司菌種室保藏。

1.2培養基

1.2.1種子培養基。葡萄糖1.500%、玉米漿2.000%、硫酸銨0500%、硫酸鎂0.100%、磷酸二氫鉀1.500%、氯化鈣0050%、氯化鈣0.600%、磷酸氫二鉀2.500%、硫酸亞鐵0.030%。

1.2.2富集培養基。葡萄糖1.500%、酪素水解物1.000%、橄欖油乳化液1.500%、硫酸銨0.500%、硫酸鎂0.100%、磷酸二氫鉀1500%、氯化鈣0.050%、氯化鈣0.600%、磷酸氫二鉀2.500%、硫酸亞鐵0.030%。

1.2.3平板初篩培養基。

牛肉膏0.300%、蔗糖1.000%、硫酸鎂0.030%、胰蛋白胨0.300%、磷酸二氫鉀0.100%、酵母膏0100%、橄欖油乳化液2.500%，0.100%去氧膽鈉。

1.2.4斜面培養基。

蔗糖3.000%、硝酸鈉0.200%、硫酸亞鐵0010%、硫酸鎂0.025%、磷酸氫二鉀0.100%、氯化鉀0050%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂1.300%。

1.2.5搖瓶復篩培養基。玉米淀粉6.000%、玉米粉1500%、豆餅粉2.000%、蔗糖0.800%、麩皮2.000%、玉米漿1.600%、磷酸氫二鉀0200%、硫酸鎂0.250%、硫酸銨0300%、硝酸鈉0.800%、氯化鈣0020%、橄欖油2.000%。

1.2.6Tris緩沖液（pH 7.0）。馬來酸2.500%、氫氧化鈉2000%、硫酸銨0.200%、硫酸鎂0.020%、二水氯化鈣0025%。

1.3試驗方法

1.3.1孢子懸液的制備。取一只新鮮培養的斜面，加入20 mL生理鹽水，用無菌鐵鏟將其表面的孢子刮下，并將其轉移至裝有玻璃珠的三角瓶中，置于搖床上振蕩打散30 min，用無菌脫脂棉過濾，濾液于10 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體用適量的生理鹽水重懸，調整孢子濃度在106～107[11]。

1.3.2ARTP誘變。取10 μL制備好的孢子懸液均勻涂布于載片中央，用無菌鑷子將載片轉移至ARTP系統操作室旋轉臺上的對應孔位上，將照射距離調整為2 mm，氣流量10SLM，功率100 W，然后設置不同的照射時間進行誘變[12]。

1.3.3亞硝基胍誘變。

1.3.3.1亞硝基胍（NTG）溶液的配制。

在生物安全柜中稱取0.035 g亞硝基胍于15 mL無菌離心管中，加入10 mL Tris緩沖液，將離心管置于熱水中待亞硝基胍完全溶解，制成NTG母液。

1.3.3.2誘變方法。

在無菌三角瓶中分別按表1加入制備好的孢子懸液、NTG母液及Tris緩沖液（其中，0#為對照組，1#、2#和3#為試驗組）。然后將三角瓶于30 ℃條件下振蕩反應30 min，反應完畢后將三角瓶里面的液體轉移至50 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入45 mL Tris緩沖液重懸，10 000 r/min離心5 min后棄上清，再加入45 mL Tris緩沖液沖洗，反復沖洗3次，以除去殘留的NTG，最后加入5 mL Tris緩沖液和5 mL 50%甘油重懸菌體。

1.3.4脂肪酶活力的測定方法。

用聚乙烯醇橄欖油乳化液法測定[13]，一個酶活定義為在測定條件下，每分鐘釋放1 μmol脂肪酸所需要的酶量。

1.3.5篩選方法。

1.3.5.1初篩方法。將誘變后的菌懸液接種到添加酪素水解物的富集培養基中，30 ℃，200 r/min條件下富集培養2 h。將富集培養結束的菌懸液稀釋至適當的倍數涂布平板，30 ℃條件下培養3 d，觀察各個菌落周圍油脂水解圈的大小及菌落形態，選取水解圈較大或菌落形態發生變化的菌株轉接至斜面培養基中。

1.3.5.2復篩方法。挑取斜面長好的菌種接入種子培養基中，30 ℃，200 r/min條件下培養3 d。將長好的種液按10%接種量轉接到發酵搖瓶中，30 ℃，220 r/min條件下培養5 d。發酵結束時，將發酵液于10 000 r/min條件下離心5 min，取上清測定酶活。

2結果與分析

2.1ARTP誘變結果

2.1.1ARTP誘變時間的確定。氣流量10SLM，功率100 W，將經ARTP處理不同時間的孢子懸液進行適當稀釋后涂布于篩選平板上，30 ℃條件下培養3 d，計算不同照射時間的致死率及正突變率，選擇合適的誘變時間。

試驗結果表明，隨著誘變時間的延長，致死率逐漸增加，當誘變時間為40 s時，致死率達到99%以上。通過計算正突變率發現，當誘變時間為30 s時，致死率達到86.7%，而正突變率為25%，此時繼續增加誘變時間正突變率隨之降低，所以試驗中將誘變時間選為30 s。

2.1.2ARTP誘變篩選結果。

經過ARTP誘變，共篩選到10

株酶活提高較大的突變菌株。搖瓶復篩結果表明，這10株正突變菌株遺傳性穩定，其酶活提高比例及產孢子結果如表3所示。試驗結果可以發現，該10株突變菌株產孢子的量比對照菌株都有不同程度地減少，其中突變菌株A45-72酶活提高了86%，產孢子量最少，所以將其選為下一步NTG復合誘變的出發菌株。

2.2 NTG誘變結果

2.2.1NTG誘變劑量的選擇。

在誘變時間為30 min的條件下，不同NTG濃度下的致死率如表4所示。試驗結果可以看出，隨著NTG濃度的提高，致死率逐漸增加。通過計算正突變率發現，隨著NTG濃度的增加，正突變率先上升后下降，當NTG終濃度為25 μg/mL時正突變率最高，此時致死率為80.7%，繼續增加NTG濃度，正突變率會相應的降低，所以試驗中選擇NTG終濃度為25 μg/mL。

2.2.2NTG誘變篩選結果。通過NTG誘變篩選到一株酶活提高較大的突變株GH-73，該突變菌株的搖瓶發酵酶活達到2 350 U/mL，相對于原始菌株酶活提高了1.2倍。該菌株的生長速度比原始菌株要慢，不產孢子。

2.3突變菌株遺傳穩定性研究

將突變菌株GH-73連續進行10代培養，以測定其遺傳穩定性，試驗結果如表5所示，該菌株10次傳代酶活均在2 200 U/mL以上，表明該突變菌株的遺傳穩定性較好。

2.4誘導劑對菌株GH-73產酶的影響

2.4.1油脂種類對菌株GH-73產酶的影響。某些微生物 只有在誘導物存在時才能產生脂肪酶[14]，采用以上搖瓶發酵培養基，在培養基中添加不同種類2%油脂作為誘導劑，采用上述發酵方法測定酶活，結果如表6所示。可以看出，誘導劑為橄欖油時，誘變菌株GH-73搖瓶發酵酶活最高，酶活為2356 U/mL，表明以橄欖油作為誘導劑時該菌株產脂肪酶活力最高。

2.4.2橄欖油的添加量對菌株GH-73產酶的影響。以橄欖油作為誘導劑，在上述搖瓶發酵培養基中添加不同用量，采用上述發酵方法測定酶活，結果如圖1所示。可以看出，在一定的濃度范圍內，隨著橄欖油添加量的增加，酶活隨之增加，當添加量為2.5%時，產酶最高，酶活為2 875 U/mL。此時，再繼續增加橄欖油的添加量，菌株產脂肪酶的活力降低。所以，發酵搖瓶中橄欖油的最佳添加量為2.5%。該試驗結果與Gupta 等[15]報道的結果相符，油脂濃度的添加量會影響菌株產脂肪酶的能力，隨著油脂濃度的升高，菌株產脂肪酶的活力相應上升，但是當油脂添加量過高時，又會抑制脂肪酶的生產。

Fig.1Effect of different volumes of olive oil on lipase production by strain GH73

2.5菌株GH-73酶學特性研究在0～50 ℃范圍內測定同一酶液的脂肪酶活力，結果如圖2所示，該酶最適溫度為

30 ℃，并且在0 ℃左右具有一定的催化活性。在0～30 ℃隨

著溫度的升高酶活相應上升，當溫度超過40℃時，酶活迅速下降，表明該突變菌株產生的脂肪酶為低溫脂肪酶。

3結論

通過ARTP和NTG復合誘變，篩選出一株酶活提高1.2倍的高產菌株GH-73，該菌株不產孢子，生長速度相對于對照菌株有所變慢，搖瓶酶活力達到2 350 U/mL，10次傳代后酶活力維持在2 300 U/mL左右，遺傳穩定性好。

以橄欖油作為誘導劑時，該菌株產脂肪酶活力最高，并且在一定的濃度范圍內，隨著橄欖油添加量的增加，酶活增加，當添加量為2.5%時產酶最高，酶活為2 875 U/mL。此時，再繼續增加橄欖油的添加量，菌株產脂肪酶的活力降低。所以，發酵搖瓶中橄欖油的最佳添加量為2.5%。

對該菌株進行酶學特性研究發現，其最適作用溫度為30 ℃，且在0 ℃左右保留30%的活性，是一種低溫脂肪酶，因此，在食品、洗滌、醫藥和環保等領域有著良好的應用前景。

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