對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中乳酸菌的篩選及其發(fā)酵工藝的研究

陳蕾蕾 鄧淑怡 劉喚明 鄧楚津

摘要[目的]對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中乳酸菌進行篩選并對其發(fā)酵工藝進行研究。[方法]首先利用含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基從蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥中篩選出有溶鈣圈的菌株M5;接著根據(jù)16SrDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析對菌株M5進行鑒定，最后在單因子實驗的基礎上，通過正交試驗對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。[結果]初步鑒定菌株M5為糞腸球菌，該菌株的最佳發(fā)酵工藝為：甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為48h。在以上工藝下，發(fā)酵液中乳酸菌的活菌數(shù)高達4.97×108CFU/mL。[結論]本研究對對蝦養(yǎng)殖所用乳酸菌的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的參考價值。

關鍵詞對蝦養(yǎng)殖環(huán)境;乳酸菌;篩選;發(fā)酵工藝

中圖分類號S968.22文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0087-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素由于具有高效、快速和廉價等優(yōu)點而被廣泛使用。在對蝦的養(yǎng)殖中，常用的抗生素有恩諾沙星、土霉素、頭孢、呋喃烯酮酸等。研究表明，傳統(tǒng)的抗生素等抗菌化學藥物的大量使用甚至濫用不僅擾亂了對蝦腸道正常的菌群，引起耐藥菌株的產(chǎn)生，而且造成環(huán)境中藥物的殘留，最終威脅著人類的健康和安全，這些問題已引起了人們廣泛的關注與焦慮[3]，因此，尋找抗生素類化學藥物的替代品成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵和熱點[4]。

乳酸菌可代替抗生素在水質改良、治療水產(chǎn)動物疾病以及水產(chǎn)動物免疫等方面的應用[5]。有研究表明采用乳酸菌拌料投喂凡納濱對蝦6周后，對蝦的免疫力增強，成活率以及弧菌的抵抗力均增強[6];乳酸菌可以抑制對蝦養(yǎng)殖過程中副溶血性弧菌的生長[7];張玲等[8]研究結果表明，通過口服與浸浴的方式對中國明對蝦和日本囊對蝦施用乳酸菌，能有效調節(jié)腸道微生物菌群組成，改善養(yǎng)殖水質，提高對蝦的成活率，提高對白斑綜合癥和副溶血弧菌病的抗病力。因此科學施用益生菌是替代當前對蝦養(yǎng)殖中的化學藥物療法、構建環(huán)境友好型對蝦養(yǎng)殖模式的必由之路[9]。

另外從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選乳酸菌報道較少，且從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選的乳酸菌應用于對蝦養(yǎng)殖有更好的適應性。本研究將從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境篩選乳酸菌，對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，為對蝦養(yǎng)殖中乳酸菌的應用提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗原料。

菌株篩選樣品：對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥。

1.1.2培養(yǎng)基。

乳酸菌初篩培養(yǎng)基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖20g，瓊脂粉10g，碳酸鈣10g，水1000mL，pH6.2～6.6，121℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃?zhèn)溆谩?/p>

乳酸菌計數(shù)培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3試驗儀器。

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，MJX-160B-Z型霉菌培養(yǎng)箱，SW-CJ-2F型潔凈工作臺，均由上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn);GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，由上海精密科技有限公司生產(chǎn);LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，由上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1乳酸菌的篩選。

將對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的水和底泥梯度稀釋后，涂布于初篩培養(yǎng)基上，將平板置于37℃培養(yǎng)48h。根據(jù)菌落是否具有溶鈣圈，以及其顏色、大小、光澤等，挑取疑似乳酸菌的單菌落，進行革蘭氏染色檢驗。凡是革蘭氏染色陽性的菌落，在MRS培養(yǎng)基上平板劃線分離純化培養(yǎng)2次，斜面保存。

1.2.2乳酸菌的鑒定。

將篩選出的菌株的16SrDNA進行擴增，擴增成功后的PCR產(chǎn)物送到上海生工公司測序，測序成功后得到的結果遞交GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，再進行相似同源性分析，然后用Maximumlikelihood法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹、BOOTSTRAP分析法分析，最后選取重復1000來評估樹的準確性[10-13]。

1.2.3乳酸菌的計數(shù)方法

乳酸菌的計數(shù)使用MRS培養(yǎng)基，將需要計數(shù)的樣品進行梯度稀釋后，涂布于MRS培養(yǎng)基，選取菌落數(shù)在30～300之間平板計數(shù)，1個稀釋度選擇兩個平板。

1.2.4單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝。

①糖蜜濃度的優(yōu)化。選取5%、10%、15%、20%、25%甘蔗糖蜜濃度作為碳源，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。②蛋白胨濃度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，添加蛋白胨作為有機氮源，6組的添加量分別為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。③硫酸銨濃度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，添加硫酸銨作為無機氮源，6組的添加量分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。④磷酸氫二鉀濃度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨濃度為0.5%，添加磷酸氫二鉀作為磷源，6組的添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，測定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。⑤發(fā)酵溫度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，接種。分別在30℃、33℃以及37℃培養(yǎng)24h，測定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。⑥發(fā)酵時間的優(yōu)化。蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種。在37℃下培養(yǎng)6h、12h、18h、24h、48h、72h，分別測定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。

1.2.5正交實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝。

在單因素實驗的基礎上，選取糖蜜濃度、蛋白胨濃度、硫酸銨濃度及磷酸氫二鉀濃度進行正交實驗，正交實驗因素和水平如表1所示

2結果與分析

2.1乳酸菌16SrDNA鑒定

將菌株M5的測序結果，通過NCBI進行16SrDNA數(shù)據(jù)庫BLAST，M5與標準菌株EnterococcusfaecalisATCC19433的相似性最高，高達99.8%。選取序列相似度達99%的部分菌種，采用軟件Mega5.05，Maximumlikelihood法制作系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。由圖1結果可知，菌株M5在系統(tǒng)發(fā)育樹上與EnterococcusfaecalisATCC19433在同一支系。綜合以上分析，可初步鑒定菌株M5為糞腸球菌。

2.2乳酸菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1糖蜜濃度對乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖2結果可知，在發(fā)酵溫度和時間相同的條件下，糖蜜濃度為5%時，乳酸菌發(fā)酵液中活菌數(shù)最多。當糖蜜濃度過高，乳酸菌代謝加快，產(chǎn)物積累，導致培養(yǎng)基的pH過低，抑制乳酸菌發(fā)酵。

2.2.2蛋白胨濃度對乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖3結果所示，隨著蛋白胨濃度的增加，發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)先增加后減少，當?shù)鞍纂藵舛葹?.5%時，乳酸菌活菌數(shù)最多。

2.2.3硫酸銨濃度對乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖4結果可知，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源以及有機氮源濃度為最優(yōu)，發(fā)酵溫度及時間相同的條件下，當硫酸銨濃度為0.4%時，乳酸菌的活菌數(shù)最多。

2.2.4磷酸氫二鉀濃度對乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖5結果可知，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、有機氮源以及無機氮源濃度最佳，發(fā)酵溫度及時間相同的條件下，磷酸氫二鉀濃度為0.4%時，乳酸菌的活菌數(shù)最多。

2.2.5發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖6結果可知，當發(fā)酵溫度為30℃時，乳酸菌活菌數(shù)最多。發(fā)酵溫度升高后，乳酸菌活菌數(shù)減少，因此，最佳發(fā)酵溫度應選擇30℃。

2.2.6發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖7結果可知：發(fā)酵時間小于48h，乳酸菌在正常的發(fā)酵繁殖，活菌數(shù)逐漸增多;在48h左右，活菌數(shù)達到最大值;在48h之后，乳酸菌數(shù)目開始逐漸減少，甚至在96h時，乳酸菌活菌數(shù)幾乎為0。因此，最佳發(fā)酵時間為48h。

2.2.7正交實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝。

在單因子實驗的基礎上，利用正交實驗對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，結果如表2所示，由表2可知，各因素的最佳水平為A1B3C3D3，即甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨濃度為0.5%，磷酸氫二鉀濃度為0.5%，并且在以上工藝下，發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)達到4.97×108CFU/mL，R值的大小分別為A>C>D>B。

3結論與討論

該試驗采用從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥篩選出的乳酸菌作為菌種，利用革蘭氏染色和16SrDNA基因序列分析進行乳酸菌的鑒定，通過單因素實驗及正交試驗，確定了糞腸球菌M5的最佳發(fā)酵工藝為：甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為48h。在以上工藝下，發(fā)酵液中的乳酸菌的活菌數(shù)高達4.97×108CFU/mL，對對蝦養(yǎng)殖所用乳酸菌的發(fā)酵生產(chǎn)有一定的參考價值。

參考文獻

[1]程秀玉，王炎松.海南省養(yǎng)殖南美白對蝦藥物殘留檢測[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2016，40（3）：1-3.

[2]桂建芳.水生生物學科學前沿及熱點問題[J].科學通報，2015，60（22）：2051-2057.

[3]ESIOBUN，ARMENTAL，IKEJ.Antibioticresistanceinsoilandwaterenvironments[J].IntJEnvironHealthRes，2002，12（2）：133-144.

[4]WANGYB，LIJR，LINJD.Probioticsinaquaculture：Challengesandoutlook[J].Aquaculture，2008，281（1/2/3/4）：1-4.

[5]張家國，劉翠玲.乳酸菌代替抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用[J].中國水產(chǎn)，2014（7）：66-68.

[6]KONGNUMK，HONGPATTARAKERET.EffectofLactobacillusplantarumisolatedfromdigestivetractofwildshrimpongrowthandsurvivalofwhiteshrimp（Litopenaeusvannamei）challengedwithVibrioharveyi[J].Fish&shellfishimmunology，2012，32（1）：170-177.

[7]WANGW，LIM，F(xiàn)ANGWH，etal.ApredictivemodelforassessmentofdecontaminationeffectsoflacticacidandchitosanusedincombinationonVibrioparahaemolyticusinshrimps[J].Internationaljuornaloffoodmicrobiology，2013，167（2）：124-130.

[8]張玲.一株對蝦腸道益生菌的篩選及其作用機理和應用效果的研究[D].青島：中國海洋大學，2007.

[9]文金順.海南土著乳酸菌篩選及其對凡納濱對蝦生長影響的研究[D].海口：海南大學，2017.

[10]楊吉霞，張利玲，蔣厚陽，等.眉山泡菜中乳酸菌的分離鑒定[J].食品科學，2015，36（17）：158-163.

[11]華鶴良.乳酸菌的分離鑒定及其抗菌肽與發(fā)酵性能研究[D].揚州：揚州大學，2014.

[12]曾議霆，郭溪浪，周康，等.富硒乳酸菌的篩選及鑒定[J].食品科學，2015，36（3）：178-182.

[13]凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：1-25.