對蝦養殖環境中乳酸菌的篩選及其發酵工藝的研究

陳蕾蕾 鄧淑怡 劉喚明 鄧楚津

摘要[目的]對蝦養殖環境中乳酸菌進行篩選并對其發酵工藝進行研究。[方法]首先利用含碳酸鈣的MRS固體培養基從蝦養殖環境中的海水和底泥中篩選出有溶鈣圈的菌株M5;接著根據16SrDNA基因序列系統發育樹分析對菌株M5進行鑒定，最后在單因子實驗的基礎上，通過正交試驗對發酵工藝進行優化。[結果]初步鑒定菌株M5為糞腸球菌，該菌株的最佳發酵工藝為：甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，發酵溫度為30℃，發酵時間為48h。在以上工藝下，發酵液中乳酸菌的活菌數高達4.97×108CFU/mL。[結論]本研究對對蝦養殖所用乳酸菌的發酵生產具有一定的參考價值。

關鍵詞對蝦養殖環境;乳酸菌;篩選;發酵工藝

中圖分類號S968.22文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0087-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

在水產養殖中，抗生素由于具有高效、快速和廉價等優點而被廣泛使用。在對蝦的養殖中，常用的抗生素有恩諾沙星、土霉素、頭孢、呋喃烯酮酸等。研究表明，傳統的抗生素等抗菌化學藥物的大量使用甚至濫用不僅擾亂了對蝦腸道正常的菌群，引起耐藥菌株的產生，而且造成環境中藥物的殘留，最終威脅著人類的健康和安全，這些問題已引起了人們廣泛的關注與焦慮[3]，因此，尋找抗生素類化學藥物的替代品成為對蝦養殖業可持續發展的關鍵和熱點[4]。

乳酸菌可代替抗生素在水質改良、治療水產動物疾病以及水產動物免疫等方面的應用[5]。有研究表明采用乳酸菌拌料投喂凡納濱對蝦6周后，對蝦的免疫力增強，成活率以及弧菌的抵抗力均增強[6];乳酸菌可以抑制對蝦養殖過程中副溶血性弧菌的生長[7];張玲等[8]研究結果表明，通過口服與浸浴的方式對中國明對蝦和日本囊對蝦施用乳酸菌，能有效調節腸道微生物菌群組成，改善養殖水質，提高對蝦的成活率，提高對白斑綜合癥和副溶血弧菌病的抗病力。因此科學施用益生菌是替代當前對蝦養殖中的化學藥物療法、構建環境友好型對蝦養殖模式的必由之路[9]。

另外從對蝦養殖環境中篩選乳酸菌報道較少，且從對蝦養殖環境中篩選的乳酸菌應用于對蝦養殖有更好的適應性。本研究將從對蝦養殖環境篩選乳酸菌，對其發酵工藝進行優化，為對蝦養殖中乳酸菌的應用提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗原料。

菌株篩選樣品：對蝦養殖環境中的海水和底泥。

1.1.2培養基。

乳酸菌初篩培養基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖20g，瓊脂粉10g，碳酸鈣10g，水1000mL，pH6.2～6.6，121℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃備用。

乳酸菌計數培養基：MRS固體培養基。

1.1.3試驗儀器。

SPX-150B-Z型生化培養箱，MJX-160B-Z型霉菌培養箱，SW-CJ-2F型潔凈工作臺，均由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產;GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，由上海精密科技有限公司生產;LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，由上海華線醫用核子儀器有限公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1乳酸菌的篩選。

將對蝦養殖環境中的水和底泥梯度稀釋后，涂布于初篩培養基上，將平板置于37℃培養48h。根據菌落是否具有溶鈣圈，以及其顏色、大小、光澤等，挑取疑似乳酸菌的單菌落，進行革蘭氏染色檢驗。凡是革蘭氏染色陽性的菌落，在MRS培養基上平板劃線分離純化培養2次，斜面保存。

1.2.2乳酸菌的鑒定。

將篩選出的菌株的16SrDNA進行擴增，擴增成功后的PCR產物送到上海生工公司測序，測序成功后得到的結果遞交GenBank數據庫中進行Blast比對，再進行相似同源性分析，然后用Maximumlikelihood法繪制系統發育樹、BOOTSTRAP分析法分析，最后選取重復1000來評估樹的準確性[10-13]。

1.2.3乳酸菌的計數方法

乳酸菌的計數使用MRS培養基，將需要計數的樣品進行梯度稀釋后，涂布于MRS培養基，選取菌落數在30～300之間平板計數，1個稀釋度選擇兩個平板。

1.2.4單因素實驗優化發酵工藝。

①糖蜜濃度的優化。選取5%、10%、15%、20%、25%甘蔗糖蜜濃度作為碳源，37℃發酵培養48h，測定發酵液中乳酸菌活菌數。②蛋白胨濃度的優化。甘蔗糖蜜濃度為5%，添加蛋白胨作為有機氮源，6組的添加量分別為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%，37℃發酵培養48h，測定發酵液中乳酸菌活菌數。③硫酸銨濃度的優化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，添加硫酸銨作為無機氮源，6組的添加量分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37℃發酵培養48h，測定發酵液中乳酸菌活菌數。④磷酸氫二鉀濃度的優化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨濃度為0.5%，添加磷酸氫二鉀作為磷源，6組的添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，測定發酵液中乳酸菌活菌數。⑤發酵溫度的優化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，接種。分別在30℃、33℃以及37℃培養24h，測定發酵液中乳酸菌活菌數。⑥發酵時間的優化。蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，配制發酵培養基，接種。在37℃下培養6h、12h、18h、24h、48h、72h，分別測定發酵液中乳酸菌活菌數。

1.2.5正交實驗優化發酵工藝。

在單因素實驗的基礎上，選取糖蜜濃度、蛋白胨濃度、硫酸銨濃度及磷酸氫二鉀濃度進行正交實驗，正交實驗因素和水平如表1所示

2結果與分析

2.1乳酸菌16SrDNA鑒定

將菌株M5的測序結果，通過NCBI進行16SrDNA數據庫BLAST，M5與標準菌株EnterococcusfaecalisATCC19433的相似性最高，高達99.8%。選取序列相似度達99%的部分菌種，采用軟件Mega5.05，Maximumlikelihood法制作系統發育樹，結果見圖1。由圖1結果可知，菌株M5在系統發育樹上與EnterococcusfaecalisATCC19433在同一支系。綜合以上分析，可初步鑒定菌株M5為糞腸球菌。

2.2乳酸菌發酵工藝的優化

2.2.1糖蜜濃度對乳酸菌發酵的影響。

由圖2結果可知，在發酵溫度和時間相同的條件下，糖蜜濃度為5%時，乳酸菌發酵液中活菌數最多。當糖蜜濃度過高，乳酸菌代謝加快，產物積累，導致培養基的pH過低，抑制乳酸菌發酵。

2.2.2蛋白胨濃度對乳酸菌發酵的影響。

由圖3結果所示，隨著蛋白胨濃度的增加，發酵液中乳酸菌活菌數先增加后減少，當蛋白胨濃度為0.5%時，乳酸菌活菌數最多。

2.2.3硫酸銨濃度對乳酸菌發酵的影響。

由圖4結果可知，在液體發酵培養基中碳源以及有機氮源濃度為最優，發酵溫度及時間相同的條件下，當硫酸銨濃度為0.4%時，乳酸菌的活菌數最多。

2.2.4磷酸氫二鉀濃度對乳酸菌發酵的影響。

由圖5結果可知，在液體發酵培養基中碳源、有機氮源以及無機氮源濃度最佳，發酵溫度及時間相同的條件下，磷酸氫二鉀濃度為0.4%時，乳酸菌的活菌數最多。

2.2.5發酵溫度對乳酸菌發酵的影響。

由圖6結果可知，當發酵溫度為30℃時，乳酸菌活菌數最多。發酵溫度升高后，乳酸菌活菌數減少，因此，最佳發酵溫度應選擇30℃。

2.2.6發酵時間對乳酸菌發酵的影響。

由圖7結果可知：發酵時間小于48h，乳酸菌在正常的發酵繁殖，活菌數逐漸增多;在48h左右，活菌數達到最大值;在48h之后，乳酸菌數目開始逐漸減少，甚至在96h時，乳酸菌活菌數幾乎為0。因此，最佳發酵時間為48h。

2.2.7正交實驗優化發酵工藝。

在單因子實驗的基礎上，利用正交實驗對發酵工藝進行優化，結果如表2所示，由表2可知，各因素的最佳水平為A1B3C3D3，即甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨濃度為0.5%，磷酸氫二鉀濃度為0.5%，并且在以上工藝下，發酵液中乳酸菌活菌數達到4.97×108CFU/mL，R值的大小分別為A>C>D>B。

3結論與討論

該試驗采用從對蝦養殖環境中的海水和底泥篩選出的乳酸菌作為菌種，利用革蘭氏染色和16SrDNA基因序列分析進行乳酸菌的鑒定，通過單因素實驗及正交試驗，確定了糞腸球菌M5的最佳發酵工藝為：甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，發酵溫度為30℃，發酵時間為48h。在以上工藝下，發酵液中的乳酸菌的活菌數高達4.97×108CFU/mL，對對蝦養殖所用乳酸菌的發酵生產有一定的參考價值。

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