樟樹的開花特性及傳粉生物學研究

劉淑娟 楊愛紅 周華 劉騰云 李彥強 鐘永達 余發新

摘要[目的]研究樟樹的開花及傳粉生物學特性。[方法]測量花部綜合特征，MTT法測花粉活性，聯苯胺-過氧化氫法測柱頭的可授性，通過異交指數、花粉胚珠比和人工授粉試驗測定樟樹的繁育系統類型，通過訪花觀察確定樟樹的主要傳粉者類型。[結果]樟樹的花較小，柱頭-花藥間存在一定的空間分離;樟樹的單花期3～4d，花粉的高活性可以持續到花開后的第3天，而柱頭具有較高的可授性是在花開的前2d;樟樹的繁育系統為兼性異交，自交親和，需要傳粉者，且樟樹的結實率受到傳粉者不足的限制，導致其自然結實率偏低，只有36.7%。[結論]該研究可為深入開展樟樹的種質資源保存、雜交育種以及良種選育等工作奠定基礎。

關鍵詞樟樹;傳粉生物學;繁育系統;結實率;花粉活性;柱頭可授性

中圖分類號S718.4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

樟樹（Cinnamomumcamphora）又名樟木、芳樟、小葉樟、烏樟等，是生長于熱帶和亞熱帶地區的優勢多用途樹種，與楠、梓、桐合稱為“江南四大名木”，為國家二級重點保護野生植物[1]。樟樹在我國既是珍貴的盛產芳香油類的經濟林樹種，又是水源涵養、河堤防護的重要防護林樹種，還是優質的園林綠化樹種，具有重要的經濟和園藝價值，廣泛分布于北亞熱帶以南地區。野生樟樹主要分布于秦嶺、長江流域以南各省區，多分布于海拔300～1000m的低山丘陵地區;人工培育的樟樹林分布更為廣泛，多栽培在海拔200m以下的丘陵、山地與平原等地區。樟樹性喜溫暖濕潤的氣候，耐濕熱、抗高溫，能夠適應40℃的高溫氣候;但不耐寒，因此一般適合種植在年平均氣溫16℃以上的亞熱帶以南地區[2-3]。樟樹的典型特征為樹形高大美觀（可達30～40m）、冠幅大、壽命長（成為古樹，壽命長達1000年以上）。樟樹木材致密美觀且切面光滑，自有一股獨特的芳香味，還可以防腐防蛀，因而被稱為“香樟”，廣泛用于制作家具、手工藝品以及供建筑、造船之用[4-5];樟樹是重要的行道樹和園林綠化樹種，病蟲害少，適宜栽種，在我國長江流域及以南地區被廣泛種植在居民小區、公園、道路兩側等。然而其結籽量大，落籽持續時間長，影響了地面的整潔與美觀，給環衛工作者帶來了不小的工作，若能通過雜交育種選育出不結籽或結籽量小的樟樹新品種，將會大大提高樟樹的景觀利用價值。

此外，隨著天然林禁伐政策的實施，我國優質用材樹種供求矛盾日益突出，尤其是珍貴闊葉材，其來源幾近枯竭。樟樹是熱帶亞熱帶常綠闊葉林的重要組成樹種之一，其高質量人工林的培育和開發利用對于緩解用材需求、滿足人們用材需求、保護環境等具有重要的作用。然而，當前樟樹的良種化水平低，尤其是材用樟樹的遺傳改良還沒有真正起步，現有樟樹通常存在生長速度慢、干形差、出材率低等問題，嚴重影響了其利用價值[6]，如果能夠通過雜交育種等措施選育出生長快、干形直、材質好的優良品種，將會極大地促進工業原料林的發展以及樹種、林種結構的調整，提高森林質量。種種需求表明，開展樟樹雜交育種工作是樟樹優良品種選育的重要途徑。現有對樟屬植物的研究還主要集中在生物學特性[7]、栽培和移植技術[8-9]、苗期的遺傳變異[10-11]、精油成分[12-13]、精油提取方法[13-15]、抗干旱及低溫脅迫[16-18]等方面，其雜交育種工作尚未起步。了解植物的繁育機理和交配系統類型是進行雜交育種和良種選育工作的前提，目前樟樹在這方面的研究還少之又少，這將嚴重阻礙其雜交育種及良種選育工作的開展，因此，對樟樹的繁育系統、交配模式及傳粉過程等進行系統性的基礎性研究勢在必行。筆者通過對樟樹花粉及柱頭活性、繁育系統、交配模式、傳粉過程等進行研究，揭示樟樹的繁育系統特性，旨在為今后深入開展樟樹的種質資源保存、雜交育種以及良種選育等工作奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

以分布于江西省科學院院內、南昌大學校內以及艾溪湖濕地公園等試驗點的樟樹為材料，試驗開展時間為2017、2018年的4—5月。樟樹的開花期為每年的4—5月，持續約30d，花小而多（圖1A），花藥2輪，內輪3個為敗育雄蕊，外輪6個花藥為可育雄蕊，柱頭1個，位于2輪雄蕊的中間（圖1B），單花花期3～4d（圖1C）。果實球形，成熟后為黑紫色，直徑約0.5cm，果實成熟期在10—11月。

1.2方法

1.2.1繁育系統。

1.2.1.1異交指數（outcrossingindex，OCI）的估算。測量花部綜合特征，包括花朵直徑、花藥開裂時間與柱頭可授期的時間間隔、柱頭與花藥的空間位置，按照Dafni[19]的標準對其進行繁育系統的描述。

1.2.1.2花粉胚珠比（pollenovuleratio，P/O）的估算。隨機采摘即將散粉的花蕾狀態的花15朵，用70%乙醇固定于離心管中并帶回實驗室。在實驗室，將整朵花放在小研缽中充分研碎，在5mL容量瓶中稀釋定容，充分振蕩搖勻，用移液槍隨機吸取5滴（每滴50μL）滴于載玻片上，在NikonE100顯微鏡100×倍數下數花粉的數量，取5滴的平均值乘以稀釋倍數100，即為該花的花粉產量[19-20]。將子房放在體視顯微鏡下解剖，并將胚珠均勻散開，統計胚珠數量。

47卷1期劉淑娟等樟樹的開花特性及傳粉生物學研究

1.2.1.3花粉活力與柱頭可授性。花粉活力測定采用MTT染色法[21-23]，事先將樟樹花苞套袋，花開一小口（針孔大小）即開始散粉，將此狀態視為開花第1天，分別選取開花第1、2、3、4天的花各10朵，帶回實驗室測花粉活性。首先滴1～2滴MTT溶液在載玻片上，然后剝掉花瓣，手持花梗將花藥部分在MTT滴液里來回蹭幾次，蓋上蓋玻片。10min后在低倍鏡下觀察，選取5個視野，每個視野花粉數在30粒以上，取其平均值作為花粉活力指標。凡是染成深紅色甚至紫黑色的花粉，其生活力為強（圖1D），紅色的次之，無色的為不具活力的花粉或不育花粉。花粉活力=某視野變色的花粉粒數目/該視野花粉粒總數×100%。

柱頭可授性測定采用聯苯胺-過氧化氫法[23]：隨機選擇處于開花前1d、開花第1天，第1、2、3、4天的花各10朵，將柱頭取下浸入凹面載玻片含有聯苯胺-過氧化氫反應液（1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22，體積比）的凹陷處。若柱頭具可授性，則柱頭周圍呈現藍色并有大量氣泡出現。根據藍色深淺和氣泡多少表示可授性強弱。

1.2.1.4套袋及人工授粉試驗。在盛花期分別選取花苞狀態的花進行套袋處理，待袋內的花苞開放后再進行人工授粉處理：①套袋人工輔助自花，取自花或同株異花的花粉作為花粉供體，授在柱頭上，然后套袋直至花凋謝;②套袋人工輔助異花，將花苞狀態的花套袋，待花開放后，選擇另一試驗點的植株作為花粉源將花粉授到柱頭上，套袋直至花凋謝;③套袋自動自花處理，一直套袋直至花凋謝;④對照處理，自然狀態，不去雄，不套袋，使其自然授粉。一個植株內不同處理用不同顏色的尼龍線標記。整個授粉處理植株內，同一種處理用同一種顏色的尼龍線標記。

1.2.2

訪花昆蟲的觀察。盛花期分別在3個試驗點隨機選取樟樹1枝，統計正在開放的花數，以30min為一個時間段，從9：00—17：00記錄來訪昆蟲的種類、訪花數量、訪花行為及訪問單花的時間，總觀察時間大于30h。

1.2.3數據分析。所有數據統計分析、做圖均采用SPSS19.0軟件，統計數據用平均值±標準差表示，N代表樣本量。

2結果與分析

2.1繁育系統

2.1.1異交指數（OCI）。按照Dafni[19]的標準進行花序直徑、花朵大小和開花行為的測量及繁育系統的評判，具體方法：①花朵或花序直徑<1mm記為0，1～2mm記為1，2～6mm記為2，>6mm記為3;②花藥開裂時間與柱頭可授期的時間間隔，同時或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1;③柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0，空間分離記為1，三者之和為OCI值。

評判標準：OCI為0時，繁育系統為閉花受精;OCI=1時，繁育系統為專性自交;OCI為2時，繁育系統為兼性自交;OCI為3時，繁育系統為自交親和，有時需要傳粉者;OCI為4時，繁育系統為部分自交親和，異交，需要傳粉者。據此標準，樟樹的開花直徑為（4.98±0.51）mm，記為2;柱頭和花藥幾乎同時成熟或雌蕊先熟，記為0;柱頭和花藥間有分離，記為1。樟樹的OCI得分為3，其繁育系統為自交親和，需要傳粉者。

2.1.2花粉胚珠比（P/O）。樟樹的平均花粉產量是2047，而胚珠數為1，因此其花粉胚珠比為2047，根據Cruden[24]的標準：P/O為2.7～5.4時，其繁育系統為閉花受精;P/O為18.1～39.0時，繁育系統為專性自交;P/O為31.9～396.0時，繁育系統為兼性自交;P/O為244.7～2588.0時，繁育系統為兼性異交;P/O為2108.0～195525.0時，繁育系統為專性異交。樟樹的P/O為2047，據此標準可判斷其繁育系統為兼性異交。

2.1.3花粉活力與柱頭可授性。樟樹花在剛開一小孔時花藥已散粉，且花粉具有較高活性，花粉高活性一直持續到花開第3天，第4天開始，花開始萎蔫，花藥和柱頭均開始變黑，花粉活力明顯降低（圖2）。柱頭在開花第1天，即花剛開一小孔時，具有較強的可授性（++），之后的第2（+）、3（+/-）天，柱頭的可授性逐漸減弱，到第4天完全失活，柱頭沒有可授性（-）。

2.1.4套袋及人工授粉試驗。套袋試驗結果發現，4種處理下的樟樹均能結實。其中，經人工異交授粉處理的結實率與結籽率均顯著高于其他處理（表1）。無論是套袋自動自花授粉還是人工輔助自花授粉，樟樹都可以結實，說明樟樹具有一定的自交親和性;而套袋后人工輔助異花授粉可以明顯提高樟樹的結實率，說明自然條件下，樟樹存在異源花粉限制。綜上所述，樟樹的繁育系統為兼性異交，自交親和。

2.2訪花昆蟲的觀察

訪花觀察發現，樟樹的主要傳粉昆蟲是食蚜蠅（Syrphidae，圖1E），其次是蜜蜂（Apismellifera，圖1F），偶爾見到蠅類訪問。食蚜蠅的訪花時間從09：00開始，隨著溫度升高，活動量也逐漸加大，至15：00—16：00，訪花的食蚜蠅最多，活動量也達到最大。食蚜蠅在訪問樟樹時，會在同一株上連續訪問十幾至二十朵花，平均每小時每花的被訪問次數為0.016次，每朵花的平均停留時間為2～3s。蜜蜂的訪花高峰期在10：00—12：00，下午相對較少，總體訪花頻率也較低，平均每小時訪花數為0.012，每朵花的停留時間為1～2s。蠅類的訪花頻率最低，偶爾可見1只，一次訪問1～2朵花。

3結論與討論

3.1樟樹的開花特性與傳粉適應樟樹的花在開放第1天，即剛剛裂開一小孔時，花藥即開始散粉且花粉具有較高的活性（大于97%），此時的柱頭同樣具有較強的可授性，但由于這個時候柱頭花藥間存在一定距離，柱頭位于花藥的下方，即柱頭花藥間在空間上有一定隔離，這大大降低了自動自花授粉的可能性[25]。隨著開花天數的推移，花粉持續保持較高活性（90%以上），但柱頭具有較強可授性僅持續2d，到了第3天，柱頭活性減弱，柱頭-花藥間的空間分離也逐漸縮小。可見，開花前期柱頭花藥空間結構上的分離是一種避免自花授粉的機制[26]。

然而，樟樹輔助自花授粉的結實率跟自然授粉的結果相似，推測自然狀態下樟樹的座果在很大程度上來自同株異化授粉，這主要依據野外訪花觀察結果。樟樹單株的開花量巨大，其主要訪花者食蚜蠅或蜜蜂會在同一棵樟樹上連續訪花10朵以上，這樣就會限制花粉的來源，造成同株異花授粉。此外，樟樹的開花期恰值陰雨季節，溫度較低，陰、雨等惡劣天氣不僅影響昆蟲訪花頻率，也影響花粉及柱頭的生活力[27]。氣象因素還影響生境內的昆蟲區系，進而影響樟樹訪花者的種類和數量[28]。樟樹的傳粉昆蟲種類單一，主要是食蚜蠅或蜜蜂，訪問頻率均較低，且食蚜蠅傳粉效率低，而樟樹的柱頭可授期短（2d），因此受天氣的影響嚴重，最終影響到樟樹的結實率，導致跟其開花量相比，樟樹的自然結實率較低，為36.7%。

3.2樟樹繁育系統類型的判定

根據Dafni[19]的標準和Gruden[24]的標準可知，兩指標的結果基本一致，樟樹的繁育系統是兼性異交，自交親和，這和人工授粉及訪花觀察的結果也是一致的。OCI檢測是從植物形態適應蟲媒傳粉出發，相對于P/O準確性更高[29]。而人工控制授粉試驗則排除了環境因素和授粉過程的差異，直接關注柱頭和花粉識別對結實率的影響，為3種方法中最為有效的檢測方式[30]。從不同來源花粉授粉的結果看，輔助自花授粉處理的結實率明顯低于輔助異株異花授粉處理，可見樟樹存在一定的近交衰退，而自然授粉的平均結實率與異株異花授粉處理之間的統計分析結果差異顯著，說明樟樹自然條件下的有性繁殖系統受到花粉限制和缺少傳粉昆蟲的影響[31-32]。該研究綜合3種測定方法的結果，判定樟樹為兼性異交，自交親和，需要傳粉者（該結果和Shivaprasad等[33]對樟屬C.sulphuratum的研究結果一致），且結實率受到傳粉者不足的限制。后續試驗將會對樟樹不同授粉處理的種子萌發情況及萌發規律做進一步研究，從種子萌發層面判定樟樹的近交衰退水平及繁育系統類型。

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