醋蛋液水解物的類蛋白反應修飾及其對膽酸結合能力的影響

鄭玥 曾慶梅

摘要[目的]探討類蛋白反應在醋蛋液水解過程中對其膽酸結合能力的影響。[方法]采用胃蛋白酶水解醋蛋液，制備水解度為43.61%，膽酸結合能力為64.01%的醋蛋液水解物，并以游離氨基減少量為試驗指標，利用響應面法優化胃蛋白酶催化的類蛋白反應修飾條件，得到不同修飾程度的產物，測定其結合膽酸的能力。[結果]修飾產物的膽酸結合能力均提高，并且結合能力最高的修飾產物的結合能力達到102.1%，該修飾產物通過乙醇∶水（7∶3）或乙醇∶水（3∶7）比例的溶劑進行離心分級后，上清液（沉淀）部分的膽酸結合能力高于（低于）修飾產物，并通過對該修飾產物和上清液部分、沉淀部分的進一步酶水解處理的結果顯示，酶水解會導致它們的結合能力降低，但是仍然高于最初的醋蛋液水解物。[結論]類蛋白反應可以提高醋蛋液水解物的膽酸結合能力和對蛋白酶抵抗的能力。

關鍵詞類蛋白反應;醋蛋液水解物;胃蛋白酶;溶劑萃取;蛋白酶抵抗

中圖分類號TS201.2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.047

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

大量科學理論證明食物蛋白水解物與膽酸結合可以阻止膽酸重吸收，從而降低內源性膽固醇濃度[1-3]。膽酸結合能力可能與水解物和肽暴露出的疏水性氨基酸殘基有關系[4]。同時，許多研究發現蛋白水解物比蛋白質本身有著更大的結合潛力[5-6]。醋蛋液是一種民間廣為流傳的飲品，它有很多藥理作用，比如免疫系統調節、消化功能提升、減輕人體內膽固醇水平、降血壓和抗氧化等作用。許多人從醋蛋液中分離出ACE抑制肽和抗氧化肽[7-8]。但是目前還沒有從醋蛋液中分離出可以結合膽酸的肽。

類蛋白反應在食品科學領域是一種很重要的反應，其反應機制具有多樣性和爭議性。在同一個反應系統中可能含有多個反應機制，主要包括水解、聚集、轉肽作用和物理聚集。主導類蛋白反應機制是由反應系統的特定條件（反應底物、酶和其他條件）決定的。類蛋白反應可以有效地去除蛋白水解物的苦味[9]，通過引進許多重要的氨基酸進入蛋白水解物的肽分子解決氨基酸組成失衡問題[10-11]。

類蛋白反應利用某些分子的氨基酸序列改變，即新的肽分子的產生和氨基酸序列的重組，改善生物活性肽提高其生理活性。Qian等[12]通過測定膽酸結合能力來研究類蛋白

反應的作用，發現類蛋白反應可以提高膽酸結合能力。Howard等[13]報道蛋白水解物通過結合膽酸由膽固醇轉化為膽酸。雞肉水解物的類蛋白反應修飾物由于肽聚集比原水解物捆綁更多的膽酸[14]。因此，利用胃蛋白酶制備醋蛋液水解物，再利用胃蛋白酶催化的類蛋白反應對水解物進行修飾，評價其膽酸結合能力和探究進一步酶水解對其結合能力的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑

胃蛋白酶，堿性蛋白酶，胰蛋白酶，上海源葉生物科技公司;其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備AG135電子水平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;BSG-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1醋蛋液水解物的制備。

雞蛋用水洗凈后，95%酒精消毒，晾干后按照1∶3（W/V）的比例放于米醋中，浸泡48h后，雞蛋被戳破攪拌獲得混合液。最后，混合液被凍成粉，便于后續分析。醋蛋粉（5g）溶解于50mL去離子水中，用1.0mol/LHCl調節pH至2.0，加入胃蛋白酶于37℃下水解1～7h，在100℃水浴中保持10min后終止反應。待冷卻到室溫后，5000r/min離心15min，取上清液測定其水解度和膽酸結合能力。具有最大結合能力的水解物被大量制備，凍干，用于類蛋白反應的底物。

1.3.2醋蛋液水解物的類蛋白反應修飾。

用胃蛋白酶對醋蛋液水解產物進行類蛋白反應修飾。采用中心組合試驗，通過測定反應體系的游離氨基量變化，利用響應面法對底物質量濃度、酶添加量、反應溫度等3個反應條件進行優化（表1），以選擇適宜的修飾反應條件。反應結束后，修飾產物在沸水浴滅酶15min，冷卻后凍干，20℃儲存備用。在優選的條件下，改變反應時間（1，3，5，7和9h）制備5個修飾產物，測定游離氨基含量及其膽酸結合能力。具有最大結合能力的修飾產物被大量制備，凍干，以備后續的溶劑萃取和進一步酶解。

1.3.3修飾產物的溶劑萃取和分離。

利用不同的介質對最大結合能力的修飾產物進行分離，10000r/min離心30min，分離出上清液和沉淀，測定其游離氨基含量和膽酸結合能力，分別凍干，用于進一步研究。

1.3.4修飾產物和上清液、沉淀部分的進一步酶解。對最大結合能力的修飾產物和離心分級產物（上清液部分和沉淀部分）分別采用胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行酶水解處理，并對其產物的游離氨基含量和膽酸結合能力進行分析測定。

1.3.5游離氨基含量、醋蛋液水解度（DH）和膽酸結合能力測定。

樣品游離氨基含量通過鄰苯二甲醛（OPA）法測定[15-16]，醋蛋液水解度通過Adler-Nissen提出的公式計算[17]，膽酸結合能力根據Kahlon和Chow提出的方法來測定[18]，使用消膽胺作為膽酸結合能力的陽性對照藥物。

2結果與分析

2.1醋蛋液水解物的制備

胃蛋白酶在人體胃環境中保持穩定，我們希望醋蛋液類蛋白修飾產物穩定存在于胃中，所以胃蛋白酶被選擇作為該研究中水解和聚集作用的催化劑[12]。醋蛋液相對于消膽胺（結合能力100%）來說具有43.21%的膽酸結合能力。由圖1可以看出，當水解時間在0～5h，制備的醋蛋液水解物的水解度從21.24%上升到43.61%，膽酸結合能力從43.21%提高到64.01%。但是，更長的水解時間不能顯著影響其結合能力。水解度為43.61%時，水解物的膽酸結合能力最大，為64.01%，因此選擇此醋蛋液水解物作為進一步修飾反應的底物。

Sun等[19]用堿性蛋白酶水解酪蛋白6h后得到水解度為10.9%，IC50為52.6μg/mL的水解物，Zhang等[20]用堿性蛋白酶水解大豆蛋白，獲得的大豆蛋白水解物水解度為14.0%，螯合鈣離子能力為41.0mg/g肽。Wei等[21]報道稱酪蛋白被水解4h時，水解物表現出最大的ACE抑制活性（42.9%）。Lin等[22]發現海瓜子的可食用肌肉部分在消化酶水解后有更強的膽酸結合能力。該研究結果與以上結論較為相近，說明在一定范圍內，某些蛋白質的膽酸結合能力和其水解度呈正相關。

2.2醋蛋液水解物的類蛋白反應修飾與產物的膽酸結合能力通過中心組合試驗，利用響應面法對底物濃度、酶添加量、反應溫度等3個反應條件進行優化（表1），共計20次試驗，以選擇適宜的修飾反應條件。采用Design-Expert8.0.6軟件設計試驗條件，對其結果進行多元線性回歸擬合，得到底物濃度（X1）、酶添加量（X2）和反應溫度（X3）的回歸方程模型：

Y=+101.76+6.58X1+2.60X2+5.25X3-1.75X1X2-3.50X1X3-7.50X2X3-4.06X12-10.42X22-5.83X32

P<0.0001，失擬項P=0.0771>0.05，說明該模型失擬不顯著，方程能夠反應游離氨基變化量與各因素之間的關系;R2=0.9536，R2Adj=0.9118，即該模型能解釋91.18%，有4.78%的變異不能用該模型解釋，說明該模型與實際擬合較好，影響因素與響應值之間的關系顯著，因此能用此模型對游離氨基變化量進行分析和預測（圖2）。A、C、BC、A2、B2、C2對應的P值小于0.01，影響極顯著，說明這幾個因素對游離氨基變化量的影響大，由F值的大小可知，3個因素對游離氨基變化量的影響順序為底物濃度>反應溫度>酶添加量。

根據所得的模型，進一步確定各因素最佳條件，得優化的提取條件：底物濃度為42.07%，酶添加量為2.47kU/gpeptides，反應溫度為32.54℃，預測的結果為104.721μmol/gpeptides。為了便于操作，將以上參數修正為：底物濃度為42.1%，酶添加量為2.5kU/gpeptides，反應溫度為32.5℃，2組平行試驗的結果分別為103.5和102.8μmol/gpeptides，平均值為103.15μmol/gpeptides，低于計算值104.721μmol/gpeptides（P>0.05），表明采用該模型得到的預測值與試驗真實值相符度高，得到的條件參數可靠。

利用這些反應條件，對醋蛋液水解物進行修飾，根據反應時間不同（1、3、5、7和9h）制備5個不同修飾程度的修飾產物（產物1～5），它們的膽酸結合能力、游離氨基變化量列于表2，結果表明，在類蛋白反應初始階段，游離氨基減少量增加，反應時間5h，游離氨基減少量最大，為103.7μmol/gpeptides，游離氨基含量下降最多，這可能是因為酶解導致的游離氨基酸的共價修飾，導致酰胺結合和肽的聚集[12]。反應時間超過5h后，游離氨基減少量不再增加，隨著反應時間的延長，水解程度不斷增強[23]。這些修飾產物的膽酸結合能力從61.3%增加到102.1%（相對于消膽胺），均比原始的醋蛋液水解物（52.7%）要高，表明類蛋白反應可以增強醋蛋液水解物的單算結合能力。因此，將反應時間為5h的修飾產物，即修飾產物5用于進一步的溶劑萃取和酶解。

2.3修飾產物的溶劑萃取

Qian等[12]報道許多水解物中的肽在類蛋白反應期間聚集形成沉淀，疏水性肽鍵可能在反應中發揮很大的作用。修飾產物5在加入不同溶劑后進行離心分級分離，分離后分別得到上清液和沉淀2個部分。由表3可知，乙醇-水溶劑（7∶3，V/V）可以有效地分離修飾產物5的活性部分，獲得的上清液相比醋蛋液水解物有著較高的膽酸結合能力，而沉淀的膽酸結合能力弱于醋蛋液水解物，結果表明低極性溶劑可以豐富疏水性肽組分。相反，乙醇-水（3∶7，V/V）有較高的極性，所以低極性肽組分在沉淀部分被發現而展現出較高的結合能力。說明疏水性肽組分存在于低極性溶劑中，可能是增加膽酸結合能力的主要原因。疏水性氨基酸因為其兩親性結構通過疏水作用結合膽酸[24]。Brownsell等[25]報道蛋白水解物在通過類蛋白修飾后，其疏水性氨基酸組成增加，從而影響其膽酸結合能力。

2.4修飾產物和分級產物進一步酶解與膽酸結合能力的變化

由表4可知，修飾產物5和它的分級產物相對于其對應的底物都有更高的游離氨基含量，表明它們均被3種酶進一步的水解。但是，進一步酶解的最終產物的膽酸結合能力低于修飾產物5（76.4%）或者分級產物（上清液106.4%，沉淀70.3%）。可見，每一個樣品的膽酸結合能力都被降低，且對胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶的水解敏感。整體來說，目前的研究表明類蛋白修飾不僅能夠提高醋蛋液水解物的膽酸結合能力，而且能夠提高其對蛋白酶的抵抗能力。在3種酶的水解之后，相比于溶劑萃取后的產物，修飾產物5具有更強的膽酸結合能力，表明醋蛋液修飾產物不能通過溶劑萃取提高其對蛋白酶抵抗的能力。

3結論

通過對胃蛋白酶水解制備的醋蛋液水解物進行類蛋白反應修飾，膽酸結合能力從52.7%提高到102.1%，以游離氨基含量減少量為指標，響應面法得到的類蛋白修飾反應條件為：底物濃度42.1%、酶添加量2.5kU/gpeptides、反應溫度25℃和反應時間5h。利用體積比為7∶3的乙醇-水溶劑對修飾產物進行離心分級處理，表明上清液的膽酸結合能力明顯高于修飾產物，但是沉淀部分則低于修飾產物。修飾產物及離心分級產物的進一步酶水解處理，表明類蛋白修飾不僅能夠提高醋蛋液水解物的膽酸結合能力，而且能夠提高其對蛋白酶的抵抗能力。

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