HPLC法測(cè)定新疆棉籽中棉酚含量

毛瓊玲 崔銀倉(cāng) 陳國(guó)通 韓飛 郭偉 張玉霞

（1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測(cè)試研究院，新疆烏魯木齊830000;2.烏魯木齊市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，新疆烏魯木齊830000;3.新疆工程學(xué)院，新疆烏魯木齊830000）

摘要[目的]通過(guò)建立高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行棉籽中游離棉酚的含量測(cè)定。[方法]樣品用乙醇提取，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。液相條件為：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm，柱溫35℃，流速0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL。[結(jié)果]游離棉酚在1.06～42.40μg/mL線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD<2%。對(duì)全疆20個(gè)棉籽進(jìn)行含量測(cè)定，樣品含量為25～4887mg/kg。[結(jié)論]該方法具有良好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、靈敏度和回收率，可以適用于棉籽中游離棉酚的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞棉籽;棉酚;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)TS207文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0216-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.063

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

棉酚（gossypol），又稱棉花毒素，是一種黃色多羥基雙萘醛化合物，主要分布在錦葵科植物樹(shù)棉、草棉或陸地棉根皮、成熟種子、莖稈中色素腺體中[1]。棉酚可分為左旋棉酚[（-）-棉酚]和右旋棉酚[（+）-棉酚]2種光學(xué)異構(gòu)體。（+）-棉酚幾乎無(wú)活性，而（-）-棉酚表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥用活性，如抗生育[2]、抗腫瘤[3]、抗病毒[4]和抗菌作用[5]。

新疆是我國(guó)棉花的主產(chǎn)區(qū)，未脫毒或脫毒未完全的棉籽飼料中含有棉酚，棉酚會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生代謝或蓄積[6]。人們食用這類動(dòng)物源性食品后，游離棉酚及其主要代謝產(chǎn)物（棉酚酮）可能會(huì)通過(guò)食物進(jìn)入人體各組織，危害人體健康[7]。為了防止棉籽餅粕中棉酚對(duì)人的傷害，對(duì)其含量的測(cè)定顯得尤為重要。目前，檢測(cè)游離棉酚的方法主要有分光光度法[8]、薄層層析法[9]、高效液相色譜法[10]等。該研究采用高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)，建立了HPLC法測(cè)定棉籽中棉酚含量的定量分析方法，并對(duì)新疆近年來(lái)棉籽中棉酚含量進(jìn)行測(cè)定和監(jiān)控。

1材料與方法

1.1試材棉酚參照品（濃度為88.2%以上），甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，乙醇、乙酸為分析純，水為一級(jí)水。

1.2儀器Agilent1260高效液相色譜儀、萬(wàn)分之一電子天平、渦旋混勻器（IKA公司）、數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3樣品制備采摘棉花后，剝?nèi)ッ奁ぃ〕雒藁ǎ粝旅拮选?duì)棉籽進(jìn)行初步打碎，把棉籽殼取出進(jìn)行再次粉碎，最后粉碎過(guò)200目篩子。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品0.0060g，加甲醇超聲溶解，待完全溶解后定容至25mL容量瓶中，搖勻備用，-20℃條件保存。棉酚標(biāo)準(zhǔn)濃度為212μg/mL。有效期為3個(gè)月。取不同體積上述標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋成不同濃度的溶液，備用。

1.4.2前處理的優(yōu)化。提取溶劑為丙酮∶水=70∶30、甲醇、乙醇、乙腈。因丙酮屬于易制毒試劑，在液相色譜圖上有響應(yīng)高的干擾峰;乙腈毒性大，且成本高;甲醇屬于工業(yè)乙醇;而乙醇提取效率高、安全性較可靠、性價(jià)比較高，對(duì)于人體的危害較小。因此，最終選用乙醇為提取溶劑。

1.4.3最大吸收波長(zhǎng)。對(duì)棉酚標(biāo)準(zhǔn)品在200～800nm條件下進(jìn)行分光光度計(jì)全波掃描，最終確定最大吸收波長(zhǎng)為235nm。

1.4.4色譜條件。Agilent1260高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器;色譜柱：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸=85∶15;流速0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm;進(jìn)樣時(shí)間20min;柱溫35℃;進(jìn)樣量10μL。

2結(jié)果與分析

2.1穩(wěn)定性試驗(yàn)取濃度為8.48μg/mL棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以2、4、6、8、10、12、16、20、24h連續(xù)進(jìn)樣9針。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰面積分別為801、798、791、785、768、773、749、732、721，可見(jiàn)峰面積穩(wěn)定，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.2精密度試驗(yàn)取濃度為10μg/mL棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積分別為890、894、888、890、890、885，通過(guò)峰面積計(jì)算RSD值為0.32%，表明該方法精密度良好。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)取6份同一樣品中棉酚含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)峰面積分別為411、421、420、417、421、423，計(jì)算峰面積的RSD值為1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4回收率試驗(yàn)對(duì)空白樣品進(jìn)行高、中、低3個(gè)濃度回收率試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），棉酚回收率為85.7%～95.8%，回收率較好。

2.5校正曲線的繪制取濃度為21.20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05、0.20、0.40、0.50、1.00、2.00mL分別置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻、備用。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），通過(guò)計(jì)算得知回歸方程為（r=0.999945），表明標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.06～42.40μg/mL線性關(guān)系良好。

2.6樣品測(cè)定稱取已制備的棉酚樣品0.2g（準(zhǔn)確至

0.0001g），加入乙醇10mL，超聲提取15min，3000r/min離

心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中;加入乙醇5mL，超

聲10min，離心，重復(fù)提取2次。將3次提取的上清液全部轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容，搖勻，避光備用。按“1.4.4”液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)棉酚含量為25～4887mg/kg。

3結(jié)論與討論

該研究建立了棉籽粕中游離棉酚的HPLC測(cè)定。樣品用乙醇提取，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。液相條件為AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm，柱溫35℃，流速0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL。游離棉酚在1.06～42.40μg/mL線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD<2%。該方法具有良好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、靈敏度和回收率，可以適用于棉籽中游離棉酚的含量測(cè)定。

對(duì)全疆不同地區(qū)25個(gè)棉籽樣品進(jìn)行含量測(cè)定，由于棉花品種及產(chǎn)地的不同，棉酚含量為25～4887mg/kg。棉酚含量較高，存在潛在的隱患風(fēng)險(xiǎn)，棉籽需要進(jìn)行脫毒處理后，才能安全使用。

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