HPLC法測定新疆棉籽中棉酚含量

毛瓊玲 崔銀倉 陳國通 韓飛 郭偉 張玉霞

（1.新疆維吾爾自治區分析測試研究院，新疆烏魯木齊830000;2.烏魯木齊市農產品質量安全檢測中心，新疆烏魯木齊830000;3.新疆工程學院，新疆烏魯木齊830000）

摘要[目的]通過建立高效液相色譜法（HPLC）進行棉籽中游離棉酚的含量測定。[方法]樣品用乙醇提取，用HPLC進行檢測。液相條件為：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，檢測波長235nm，柱溫35℃，流速0.8mL/min，進樣量10μL。[結果]游離棉酚在1.06～42.40μg/mL線性關系良好，精密度、穩定性、重復性的RSD<2%。對全疆20個棉籽進行含量測定，樣品含量為25～4887mg/kg。[結論]該方法具有良好的穩定性、準確度、靈敏度和回收率，可以適用于棉籽中游離棉酚的含量測定。

關鍵詞棉籽;棉酚;高效液相色譜法

中圖分類號TS207文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0216-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.063

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

棉酚（gossypol），又稱棉花毒素，是一種黃色多羥基雙萘醛化合物，主要分布在錦葵科植物樹棉、草棉或陸地棉根皮、成熟種子、莖稈中色素腺體中[1]。棉酚可分為左旋棉酚[（-）-棉酚]和右旋棉酚[（+）-棉酚]2種光學異構體。（+）-棉酚幾乎無活性，而（-）-棉酚表現出更強的藥用活性，如抗生育[2]、抗腫瘤[3]、抗病毒[4]和抗菌作用[5]。

新疆是我國棉花的主產區，未脫毒或脫毒未完全的棉籽飼料中含有棉酚，棉酚會在動物體內發生代謝或蓄積[6]。人們食用這類動物源性食品后，游離棉酚及其主要代謝產物（棉酚酮）可能會通過食物進入人體各組織，危害人體健康[7]。為了防止棉籽餅粕中棉酚對人的傷害，對其含量的測定顯得尤為重要。目前，檢測游離棉酚的方法主要有分光光度法[8]、薄層層析法[9]、高效液相色譜法[10]等。該研究采用高效液相色譜檢測技術，建立了HPLC法測定棉籽中棉酚含量的定量分析方法，并對新疆近年來棉籽中棉酚含量進行測定和監控。

1材料與方法

1.1試材棉酚參照品（濃度為88.2%以上），甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為優級純，乙醇、乙酸為分析純，水為一級水。

1.2儀器Agilent1260高效液相色譜儀、萬分之一電子天平、渦旋混勻器（IKA公司）、數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3樣品制備采摘棉花后，剝去棉皮，取出棉花，留下棉籽。對棉籽進行初步打碎，把棉籽殼取出進行再次粉碎，最后粉碎過200目篩子。

1.4試驗方法

1.4.1標準溶液配制。稱取棉酚標準品0.0060g，加甲醇超聲溶解，待完全溶解后定容至25mL容量瓶中，搖勻備用，-20℃條件保存。棉酚標準濃度為212μg/mL。有效期為3個月。取不同體積上述標準溶液用甲醇稀釋成不同濃度的溶液，備用。

1.4.2前處理的優化。提取溶劑為丙酮∶水=70∶30、甲醇、乙醇、乙腈。因丙酮屬于易制毒試劑，在液相色譜圖上有響應高的干擾峰;乙腈毒性大，且成本高;甲醇屬于工業乙醇;而乙醇提取效率高、安全性較可靠、性價比較高，對于人體的危害較小。因此，最終選用乙醇為提取溶劑。

1.4.3最大吸收波長。對棉酚標準品在200～800nm條件下進行分光光度計全波掃描，最終確定最大吸收波長為235nm。

1.4.4色譜條件。Agilent1260高效液相色譜儀，紫外檢測器;色譜柱：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇-0.1%磷酸=85∶15;流速0.8mL/min;檢測波長為235nm;進樣時間20min;柱溫35℃;進樣量10μL。

2結果與分析

2.1穩定性試驗取濃度為8.48μg/mL棉酚標準溶液分別以2、4、6、8、10、12、16、20、24h連續進樣9針。結果發現，峰面積分別為801、798、791、785、768、773、749、732、721，可見峰面積穩定，表明該方法穩定性良好。

2.2精密度試驗取濃度為10μg/mL棉酚標準溶液連續進樣6針，峰面積分別為890、894、888、890、890、885，通過峰面積計算RSD值為0.32%，表明該方法精密度良好。

2.3重復性試驗取6份同一樣品中棉酚含量進行檢測，發現峰面積分別為411、421、420、417、421、423，計算峰面積的RSD值為1.0%，表明該方法重復性良好。

2.4回收率試驗對空白樣品進行高、中、低3個濃度回收率試驗檢測，結果發現（表1），棉酚回收率為85.7%～95.8%，回收率較好。

2.5校正曲線的繪制取濃度為21.20μg/mL的標準儲備液0.05、0.20、0.40、0.50、1.00、2.00mL分別置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻、備用。以標準液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線（圖1），通過計算得知回歸方程為（r=0.999945），表明標準曲線在1.06～42.40μg/mL線性關系良好。

2.6樣品測定稱取已制備的棉酚樣品0.2g（準確至

0.0001g），加入乙醇10mL，超聲提取15min，3000r/min離

心5min，將上清液轉移至25mL容量瓶中;加入乙醇5mL，超

聲10min，離心，重復提取2次。將3次提取的上清液全部轉移至25mL容量瓶中，定容，搖勻，避光備用。按“1.4.4”液相色譜條件進行測定，發現棉酚含量為25～4887mg/kg。

3結論與討論

該研究建立了棉籽粕中游離棉酚的HPLC測定。樣品用乙醇提取，用HPLC進行檢測。液相條件為AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，檢測波長235nm，柱溫35℃，流速0.8mL/min，進樣量10μL。游離棉酚在1.06～42.40μg/mL線性關系良好，精密度、穩定性、重復性的RSD<2%。該方法具有良好的穩定性、準確度、靈敏度和回收率，可以適用于棉籽中游離棉酚的含量測定。

對全疆不同地區25個棉籽樣品進行含量測定，由于棉花品種及產地的不同，棉酚含量為25～4887mg/kg。棉酚含量較高，存在潛在的隱患風險，棉籽需要進行脫毒處理后，才能安全使用。

參考文獻

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安徽農業科學，J.AnhuiAgric.Sci.2019，47（1）：218-220