小麥面粉和鮮面片色澤及 Psy-A1 與 Ppo-A1 等位變異檢測

張 曉，高德榮，李 曼，劉大同，吳素蘭，江 偉，呂國鋒

(江蘇里下河地區農業科學研究所/農業部長江中下游小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225007)

小麥面粉色澤是面粉品質的重要指標，也是衡量面粉加工精度的重要指標，在很大程度上反映了面粉的質量和制粉精度[1]。長期以來我國人民有喜食高白度面食的習慣[2]，面粉白度對面條、饅頭、包子和餃子等食品的評分有重要影響，色澤評分一般占蒸煮類食品總評分的20%～30%[3]。市場上銷售面粉的白度一般達到80以上才易被認可[4]。為提高市場競爭力，面粉廠在面粉生產過程中普遍使用化學增白劑，長期過量食用對人體有害。研究表明，小麥品種是影響面粉色澤最重要的因素[5-6]。劉建軍等[5]對 4 個環境條件下 104 個小麥品種(系)的研究結果表明，氣候因子、土壤條件及栽培措施和品種對小麥面粉白度均有顯著作用，但品種的作用更為重要。胡瑞波等[6]研究表明，面粉白度、色澤(L*、a*、b*)的基因型方差均大于環境和環境與基因型互作方差。了解大面積推廣品種面粉和面片色澤，可為小麥品質改良提供重要信息。

小麥面粉及其制品色澤主要受出粉率、硬度、蛋白質含量、多酚氧化酶(PPO)活性、黃色素含量和脂肪氧化酶活性等因素影響[7-10]。研究表明，PPO是造成面粉或面制食品顏色酶促褐變的主要原因，表型貢獻率高達50%～70%[11-14]。張立平等[15]定位了分別位于2AL、2DL染色體上的PPO活性主效QTL，并認為2AL上的QTL效應較大。Sun等[16]開發了位于2AL上PPO活性主效基因的STS標記PPO18，能有效區分控制PPO活性的等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b。黃色素是小麥籽粒中最主要的天然色素，與面粉白度關系密切[8,17]。類胡蘿卜素是黃色素的主要成分，八氫番茄紅素合酶(Psy)是植物類胡蘿卜素合成途徑中的限速酶[18-19]。黃色素含量受多個基因位點的調控，其中位于7AL的主效QTL，在不同環境中解釋12.9%～37.6%的表型變異[20]。He等[21]根據玉米的Psy1基因克隆了小麥7A染色體上的Psy-A1基因，并開發了共顯性標記YP7A，能檢測等位基因Psy-A1a和Psy-A1b。

付曉潔等[22]對138份陜西歷史和主栽品種的PPO活性基因等位變異進行了檢測。楊芳萍等[23]對157份小麥品種和新品系進行了黃色素含量和PPO相關基因的檢測。張國叢等[24]對河北省主推小麥品種進行了面粉色澤狀況研究。胡鳳靈等[25]對221份小麥品種和新品系進行了黃色素含量和PPO活性基因的分子標記檢測。王 蕾等[26]對173份小麥品種PPO活性基因等位變異及面粉白度特性進行了分析。姜小苓等[27]研究了216份不同種植區小麥品種(系)的面粉白度的變異。相吉山等[28]對182份新疆小麥品種(系)的面粉色澤及Psy-A1、Ppo-A1、Ppo-D1等基因等位變異進行了檢測。

前人的研究多為小麥品種面粉色澤或者分子檢測，尚未見對小麥品種(系)面粉、鮮面片色澤及其與Ppo-A1、Psy-A1等位變異關系的系統研究。本研究擬以主要麥區17個當前大面積推廣品種及1個優異品系為材料，檢測其面粉白度、面粉和放置不同時間鮮面片的L*值、a*值、b*值和Psy-A1、Ppo-A1基因等位變異，分析不同等位變異對面粉和鮮面片色澤的影響，以期為高白度小麥新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設計

試驗材料為我國主要麥區當前大面積推廣品種及優異品系共18份(表1)。2012-2013和2013-2014年度種植于江蘇里下河地區農科所基地。試驗采用隨機區組設計，2次重復，5行區，行長1.2 m，行距0.25 m。試驗施純氮210 kg·hm-2，基肥∶分蘗肥∶拔節肥為5∶1∶4，基肥于播種前一天施用，分蘗肥于4 葉期施用，拔節肥于葉齡余數2.5 葉期施用，磷、鉀肥均是105 kg·hm-2，全部基施。田間管理與大田生產一致，生長期間沒受到自然災害，正常成熟，按小區收獲脫粒，晾曬除雜后統一磨粉。

1.2 方 法

1.2.1 面粉制備

用MLU-202型Buhler磨粉機磨粉，根據籽粒硬度，將小麥籽粒含水量調整至14%～15%，潤麥18～20 h，參照AACC26-20方法磨粉。

1.2.2 面坯制作

稱取小麥粉30 g(15%濕基)，根據面粉筋力和吸水率加入小麥粉質量28%～32%的蒸餾水；用針式和面機攪拌5 min。使用實驗室專用面條機將和好的坯料在壓輥間距4 mm處壓片成型，將面片置于醒發箱中醒發30 min之后，取出面片將厚度壓為2.5 mm。用塑料封口袋將面片保存于恒溫25 ℃的空調房內(用足量空氣將封口袋撐開，防止封口袋與面片測試面接觸)。分別于0、2、4 h取樣測定面片的色澤。

1.2.3 面粉白度測定

利用國產智能白度儀(WSB-Ⅳ,杭州麥哲儀器有限公司)測定，每個樣品重復2次，兩次數值之差不超過0.5。

表1 參試材料基本信息Table 1 Information of wheat varieties(line) tested in this study

1.2.4 面粉及其制品色澤的測定

采用色彩色差計(CR-400，日本Konica Minolta公司)測定，以D65的CIE-L*、a*、b*色度系統表示。L*值表示亮度和白度，L*值高則白度和亮度高；a*值表示紅綠度，值大則紅度高；b*值表示黃藍度，值大則黃度高。面片每個樣品取面坯色澤均勻的兩個不同點測量兩次，取平均值。

1.2.5 分子標記鑒定

樣品基因組DNA提取采用SDS法[28]。利用Sun等[16]和He等[21]開發的分子標記，檢測Psy-A1、Ppo-A1的等位變異(表2)。采用10 μL的PCR反應體系，其中包含2×Taq Master Mix 5 μL，20 ng·μL-1的模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.2 μL。PCR擴增程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55/52 ℃ 30 s，72 ℃ 65 s，35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.3 統計方法

采用Excel 2013進行數據整理，采用SPSS進行數據統計、分析。

表2 分子標記PCR引物序列Table 2 PCR primers of molecular markers used in the study

2 結果與分析

2.1 不同材料面粉和面片色澤分析

由表3可看出，不同小麥品種(系)間面粉白度差異程度不同，泛麥5號白度最高，且與其他品種(系)差異均顯著；其次是川麥42和揚麥18；濟麥22最低；泛麥5號、川麥42、揚麥18、揚麥20、揚麥9號、平安7號、新麥19和偃展4110面粉白度均大于80。不同品種(系)間面粉L*值的差異程度不盡相同，以泛麥5號最高，且與揚麥18以外的其他品種(系)差異均顯著；其次是新麥19和川育21526；濟麥22最低。就面粉a*值而言，揚麥20最高，且顯著高于其他品種(系)；其次是石麥15；川育21526最低。對面粉b*值，以濟麥22最高，且與其他品種(系)差異均顯著；其次是矮抗58；川麥42最低。放置0 h鮮面片L*值，以揚麥18、泛麥5號、揚麥9號和平安7號較高，4個品種間無顯著差異；其次是揚麥20；濟麥22最低。放置0 h鮮面片a*值，以川麥42最高；其次是揚麥16、濟麥22、石麥15和揚麥20；矮抗58最低。放置0 h鮮面片b*值，以矮抗58最高，且與其他品種(系)差異均顯著；其次是濟麥22；川麥42最低。供試材料放置2和4 h鮮面片的色澤差異與0 h的表現基本一致。

表3 不同材料面粉和0 h鮮面片色澤比較Table 3 Flour and fresh dough sheet color at 0 hour of different wheat materials

同列數據后不同小寫字母表示不同材料間在0.05水平上差異顯著。

Different small letters in same column mean significant difference among the materials at 0.05 level.

2.2 面粉和不同靜置時間面片色澤的相關性

相關分析(表4)表明，面粉白度與面粉L*值呈極顯著正相關，與面粉b*值呈極顯著負相關，但與面粉a*值相關不顯著。面粉白度與放置不同時間鮮面片的L*值呈極顯著正相關，與鮮面片的a*值和b*值呈極顯著負相關。面粉與放置不同時間鮮面片的L*值、a*值、b*值間均呈極顯著正相關。面粉及放置不同時間鮮面片的L*值與其a*、b*值呈極顯著負相關，a*值和b*值間無顯著相關性。

2.3 Psy-A1、 Ppo-A1基因等位變異對面粉和面片色澤影響

2個基因位點各檢測到2種等位變異(表5)，均對面粉白度、L*值、0 h鮮面片L*值、4 h鮮面片a*值無顯著效應(表6)。Ppo-A1對面粉及鮮面片b*值、鮮面片放置2 h和4 h的L*值有顯著影響；對b*值效應表現為Ppo-A1bPpo-A1a。Psy-A1對面粉及放置0 h和2 h鮮面片a*值、鮮面片b*值有顯著或極顯著效應；對a*值效應表現為Psy-A1b>Psy-A1a；對b*值效應表現為Psy-A1b

表4 面粉和面片色澤的相關性Table 4 Correlation between flour and fresh dough sheet color

*：P<0.05;**:P<0.01.

2.4 Psy-A1、 Ppo-A1基因等位變異組合對面粉和面片色澤的影響

共檢測到Psy-A1、Ppo-A1基因等位變異組合4種(表7)，4種基因型面粉白度差異不顯著，但基因型組合Ppo-A1b/Psy-A1b面粉白度值最高，平均80.6，其次是Ppo-A1b/Psy-A1a和Ppo-A1a/Psy-A1b，Ppo-A1a/Psy-A1a最低。對鮮面片b*值，以Ppo-A1a/Psy-A1a基因型組合最高，其他三種基因型組合差異不顯著；其他面粉或面片被測色澤指標間差異均不顯著。

表5 不同材料的 Ppo-A1和 Psy-A1基因型Table 5 Allelic gene at Ppo-A1 and Psy-A1 loci in different wheat materials

表6 2個基因不同等位變異對面粉和面片色澤的影響Table 6 Effect of alleles of two genes on flour and fresh dough sheet color

*：P<0.05;**:P<0.01.

表7 2個基因不同等位變異組合對面粉和面片色澤影響Table 7 Flour and dough sheet color of different allelic combination at Ppo-A1 and Psy-A1 loci

同列數值后不同字母表示不同組合間差異顯著(P<0.05)。

Different letters after the values in the same columns mean significant differences among the four allelie combinations at 0.05 level.

3 討 論

L*值是表示面粉亮度和白度的指標，L*值=0表示黑色，L*值=100表示白色。a*值、b*值構成一個直角坐標，決定色調，也稱彩度系數，其中，+a*值越大顏色越接近純紅色，-a*值越大，顏色接近純綠色；+b*值越大黃色增加，-b*值越大，藍色增加。本研究結果表明，泛麥5號、川麥42、揚麥18、揚麥20、平安7號、新麥19、揚麥9號、偃展4110、川育21526面粉白度均達80，L*值均高于93，b*值均低于6.5，面粉色澤好。制成鮮面片后，L*值較高的品種依次是揚麥18、泛麥5號、揚麥9號、平安7號、揚麥20，b*值較低的品種依次是川麥42、泛麥5號、揚麥20、揚麥18、揚麥9號、平安7號。由此可見，揚麥18、泛麥5號、揚麥9號、平安7號、揚麥20面粉色澤較好，鮮面片L*值高，b*值較低，面粉和面片色澤均比較好。前人研究表明，川麥42和偃展4110面粉白度均較高[26-27]，這與本研究結果一致。制成鮮面片后，川麥42的b*值雖最低，但L*值僅高于濟麥22、石麥15和揚麥16，說明川麥42只能作為優異低黃度的種質資源；偃展4110的鮮面片L*值較面粉顯著降低，b*值顯著升高，說明這兩個品種面粉色澤好，但不適于制作高白度面制食品。

本研究結果表明，面粉白度與面粉及鮮面片L*值呈極顯著正相關，與面粉和鮮面片b*值呈極顯著負相關；面粉及放置不同時間鮮面片的L*值與其a*、b*值呈極顯著負相關。說明面粉的白度與面粉的色澤顯著相關，面粉的色澤與面片色澤顯著相關，這與王 蕾等[26]研究結果一致。但面粉色澤和面片色澤的表現不盡相同，如川麥42和偃展4110，可能由于面粉加水后PPO活性存在差異，因此，小麥育種中，尤其是高世代材料需加強鮮面片色澤篩選鑒定，提高選擇的準確度和效率。

對影響面粉色澤的基因，2AL染色體上基因位點的效應相對更大，可解釋表型的37.2%～50.1%，而2DL染色體上的基因僅解釋表型的25.1～29.1%，本研究僅對2AL染色體上的基因進行了檢測。本研究結果表明，Psy-A1位點主要引起鮮面片a*值和b*值顯著變化，Psy-A1a的面片黃度顯著高于Psy-A1b，Psy-A1a的面粉和面片紅度顯著低于Psy-A1b。相吉山等[28]研究表明，Psy-A1基因對面粉黃度的影響與本研究一致，但Psy-A1a的面粉紅度和黃度極顯著高于Psy-A1b。Ppo-A1基因對面粉及鮮面片b*值、鮮面片放置2 h和4 h的L*值有顯著影響，對b*值效應表現為Ppo-A1bPpo-A1a，這主要與PPO在面粉加工過程中的活性有關。Sun[16 ]和孔欣欣等[29]研究表明，PPO-A1a基因型PPO活性顯著高于PPO-A1b。面粉尤其是在制作成面片過程中，酶活性增加會引起面片褐變，亮度降低，黃度值增加[30]。相吉山等[28]研究表明，含Ppo-A1a面粉紅度顯著低于Ppo-A1b，而面粉亮度、黃度、白度的差異均不顯著，這與本研究結果不一致，可能與所選材料以及出粉率不同造成麩星含量不同有關。

18份材料的4種Psy-A1、Ppo-A1基因等位變異組合，面粉白度差異雖不顯著，但基因型Ppo-A1b/Psy-A1b面粉白度值最高；4種基因型鮮面片b*值，以Ppo-A1a/Psy-A1a基因型最高，其他三種基因型差異不顯著；其他面粉或面片色澤指標差異不大。說明通過這2個基因等位變異能在一定程度上改良面粉和面片色澤。

4 結 論

揚麥18、泛麥5號、揚麥9號、平安7號、揚麥20具有優良的基因型和面粉及鮮面片色澤。Psy-A1基因主要引起鮮面片a*值和b*值顯著變化，Ppo-A1基因對面粉及鮮面片b*值、放置2 h和4 h的鮮面片L*值有顯著影響。Psy-A1、Ppo-A1等位變異組合對鮮面片b*值存在極顯著影響，Ppo-A1a/Psy-A1a基因型最高，其他三種基因型差異不顯著。面粉的白度與面粉的色澤顯著相關，面粉的色澤與面片色澤顯著相關。但Ppo-A1、Psy-A1主要引起了鮮面片色澤的差異。因此，需通過對面粉和面制品色澤進行共同鑒定，以提高選擇的準確度和效率。