維生素E琥珀酸酯聯合化療藥物對乳腺癌增殖的抑制作用

楊睿，時冉冉

（漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462000）

0 引言

乳腺癌是一種多發的女性疾病，近年來發病率逐年上升，2012年國家疾控中心的調查結果顯示乳腺癌的發病率為42.55%，居女性惡性腫瘤的首位[1]。乳腺癌病因復雜，晚育、酗酒、基因等都是與之相關的因素。化療是常用的乳腺癌治療方法，但對身體的副作用大。維生素E琥珀酸酯是一種新型抗癌藥物，副作用小，能夠誘導癌細胞凋零。本文探究維生素E琥珀酸酯聯合化療藥物對乳腺癌增殖的抑制作用，旨在為乳腺癌臨床用藥提高實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本實驗使用到的材料有維生素E琥珀酸酯（VES）、絲裂霉素(MMC)、環磷酰胺(CTX)、人乳腺癌細胞株Bcap-37，其中維生素E琥珀酸酯的生產廠家為SIGMA公司，絲裂霉素的生產廠家為浙江海正藥業股份有限公司，環磷酰胺的生產廠家為上海華聯制藥有限公司，MTT的生產廠家為AMRESCO,人乳腺癌細胞株Bcap-37購自中科院上海細胞所。

1.2 方法

把Bcap-37細胞置于含10%牛血清的RPMI1640的培養基中培養，環境溫度設置為37℃，二氧化碳濃度為5%。用無水乙醇溶解維生素E琥珀酸酯，濃度設置為20μg/mL。溶解CTX、MMC，濃度分別設定為:300μg/mL、3.3μg/mL。把人乳腺癌細胞株 Bcap-37分為3組，分別加入維生素E琥珀酸酯、環磷酰胺及絲裂霉素，作用24h、36h后觀察Bcap-37的生長狀況[2]。并設置一組不加任何藥物的含人乳腺癌細胞株Bcap-37的培養基作為對照組。

1.3 檢測項目及方法

1.3.1 乳腺癌細胞增殖檢測

接種人乳腺癌細胞株Bcap-37，將其置于96孔板上，每個孔注入濃度為2×104/mL的Bcap-37細胞株200μL，此外，每組設置6個復孔。細胞接種后24h在孔板上加入不同濃度的VES、CTX及MMC進行藥物處理，之后再加入濃度為5g/L的MTT，每個孔中加入20μL。孵箱溫度保持在37℃，培養4h之后除去孔中的上清液，再加入DMSO，每孔加入150μL。之后把孔板置于震蕩臺上震蕩5min，使用自動酶標儀進行比色，并測定細胞的吸光值A（492nm）。最后通過吸光值測定出不同濃度、種類的藥物對Bcap-37細胞的生長抑制率[3]。計算公式為:抑制率（%）=（對照組平均吸光值A-實驗組平均吸光值A）/對照組平均吸光值A×100%。

1.3.2 流式細胞儀分析細胞周期

把Bcap-37細胞接種于6孔板上，細胞濃度為5×104。并加入 20μg/mLVES 和 3.3μg/mL 的 MMC，或者是 20μg/mLVES的 300μg/mLCTX，作用 24h后，將培養液離心處理，去除培養液，制成細胞懸濁液。并在懸濁液中加入70%冰乙醇，之后再加入PI，溫度保持在4℃，置于黑暗處30min。并設置未經藥物處理的細胞作為對照。最后將細胞懸濁液進行上機分析，每個標本設置為10000個細胞，分析細胞凋亡率和細胞周期。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞表面Fas表達

把Bcap-37細胞接種于6孔板上，細胞濃度為5×104。并加入 20μg/mLVES 和 3.3μg/mL 的 MMC，或者是 20μg/mLVES的 300μg/mLCTX，作用 24h后，將培養液離心處理，去除培養液，制成細胞懸濁液。之后在細胞懸濁液中加入PE標記的FAS抗體靜置30min，并使用PBS漂洗3次[4]，最后使用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.4 統計學方法

采取SPSS 20.0統計學軟件對本文數據進行分析處理，計數資料用n、%表示，組間比較采用t、χ2檢驗，當差異具有統計學意義時，P＜0.05。

2 結果

2.1 VES與化療藥物聯合對與乳腺癌細胞的生長抑制作用

單一使用VES、MMC、CTX對乳腺癌細胞生長的抑制作用在24、36h內分別為:38.47%、52.73%；59.06%、64.25%；28.85%、46.91%。VES與 化 療 藥物聯合使用對乳腺癌細胞的生長抑制作用明顯增強，分別為76.70%、90.14%；64.13%、80.88%。與使用單一藥物相比，明顯增強，具有統計學意義，P＜0.05（與MMC相比作用不顯著）。

2.2 VES與化療藥物聯合對癌細胞凋亡率的影響

Bcap-37細胞的自然凋亡率為0.7%，單獨使用VES、MMC、CTX時Bcap-37細胞的凋亡率在24h內分別為:19.2%、16.7%、12.3%。VES與化療藥物MMC、CTX聯合使用時，Bcap-37細胞的凋亡率在24h內分別提高到4.8%、39.6%。

2.3 乳腺癌細胞表面Fas表達受VES聯合化療藥物的影響

對照組的乳腺癌細胞表面Fas表達平均熒光強度和陽性率分別為4.09、92.5%。經VES與化療藥物MMC、CTX聯合處理后，其平均熒光強度和陽性率分別為:22.0、100%；18.7、100%。

表1 VES、MMC、CTX單獨使用與聯合作用與癌細胞A值、抑制率的關系

3 討論

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，發病率高，占女性腫瘤發病率的31%，嚴重威脅著女性的健康，常用的治療方法有藥物治療和手術治療。研究表明[5]，化療藥物聯合使用對乳腺癌細胞的抑制作用增強。醫學界常常使用引用新藥物的辦法來提高化療的有效性，維生素E琥珀酸酯是一種新型藥物。Turley等人發現維生素E琥珀酸酯能夠產生誘導效應，使淋巴瘤細胞凋亡。隨后人們對其開始了廣泛的研究，發現它不僅僅能使淋巴瘤細胞凋亡，對胃癌、前列腺癌、乳腺癌等上皮組織來源的惡心腫瘤都有十分有效的誘導凋亡作用。常用的化療藥物副作用大，會對人體造成較大傷害，尤其是對身體虛弱的癌癥患者而言，使用化療藥物是具有一定危險性的。維生素E琥珀酸酯是維生素E的一種衍生物，具有毒副作用小的效果，其發現提高了化療治療乳腺癌的用藥安全性。

本文設置了兩個對照，不加任何化學藥物的乳腺癌細胞培養基，和加了常用化療藥物絲裂霉素和環磷酰胺的細胞培養基。用于對比單獨用藥和聯合維生素E琥珀酸酯用藥的效果。結果表明:VES、MMC、CTX聯合使用能夠調控細比使用單一藥物相比對乳腺癌細胞的抑制作用更明顯，具有統計學意義，P＜0.05。為何聯合用藥效果更好，猜想維生素E琥珀酸酯在抑制乳腺癌細胞的過程中與MMC、CTX產生了協同作用。已知Fas/FasL是癌細胞死亡的三大因子之一，在誘導癌細胞凋零的過程中起到了重要的作用。從流式細胞分析儀的分析結果來看，VES能夠調控Fas/FasL促使癌細胞凋亡，且VES聯合用藥后Fas的平均熒光強度和陽性率從4.09、92.5%提高到了22.0、100%；18.7、100%，Fas表達增強。綜上，VES、MMC、CTX聯合使用能夠增強乳腺癌細胞Fas的表達，抑制其生長。