高效液相色譜法測(cè)定天麻中7種成分含量

李俊婕，刁飛燕，胡德福，姜巖，于向紅，李啟艷

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.國(guó)家中藥品種保護(hù)審評(píng)委員會(huì)，北京 100070)

天麻是我國(guó)常用名貴中藥材之一，具有兩千多年的藥用歷史， 稱為“治風(fēng)之神藥”。近代的天麻炮制主要是麻切制、蒸制等法[1]。《中國(guó)藥典》中描述天麻為蘭科植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖，立冬后至次年清明前采挖，立即洗凈，蒸透，敞開低溫干燥。具有平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的功效[2]。天麻主產(chǎn)于云南、貴州、四川、陜西及河南等省[3]?，F(xiàn)代研究表明，天麻具有鎮(zhèn)靜安眠、抗驚厥、增智健腦、延緩衰老等保健作用，張建軍[4]通過試驗(yàn)證實(shí)天麻素及其苷元是主要的活性成分。文獻(xiàn)有關(guān)天麻化學(xué)成分的報(bào)道主要包括酚類化合物及其苷類、甾醇及有機(jī)酸類、多糖類、微量的維生素A類物質(zhì)、AmD2-9、AmD2-20(新型生物堿) 多種氨基酸、微量元素等[5-6]。目前關(guān)于天麻質(zhì)量控制的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)還主要是天麻素和對(duì)羥基苯甲醇兩個(gè)組分的測(cè)定，關(guān)于天麻化學(xué)成分含量測(cè)定的報(bào)道集中在天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、天麻多糖、微量元素測(cè)定和其中一兩種巴利森苷的測(cè)定等方面[7-8]。劉玉紅等[9]建立了測(cè)定天麻藥材中游離天麻素和總天麻素的方法;程芬等[10]通過測(cè)定比較栽培天麻與野生天麻中天麻素、氨基酸、總黃酮的量，來(lái)選擇天麻的最佳栽培方式;本試驗(yàn)所建立的方法對(duì)天麻藥理活性突出的7種組分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、加標(biāo)回收率等一些方法學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確地測(cè)定天麻中腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷 A、巴利森苷 B、巴利森苷 C、巴利森苷E 7種成分含量，為更好地控制天麻的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 試樣及試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，PDA 檢測(cè)器和Empower3 工作站(美國(guó)Waters公司)；Milli-Q超純水機(jī)(密理博公司)；Mettler Toledo MS105DU分析天平(十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑、樣品 天麻素(批號(hào)：11807-201620)、對(duì)羥基苯甲醇(批號(hào)：11970-201702)、腺苷(批號(hào)：11879-201703)對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；巴利森苷 A(批號(hào): P10O7F22270)、巴利森苷 B(批號(hào): P11J7F17626)、巴利森苷 C(批號(hào):P11J7F17625)、巴利森苷 E(批號(hào): P10J8F28472)由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供。乙腈(HPLC 級(jí)，德國(guó)Merck 公司)，其他試劑均為分析純。本次起草共收集到保健食品原料天麻25批，樣品信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL流速1.0 mL·min-1；流動(dòng)相A為0.1%磷酸溶液，B 為甲醇；梯度洗脫程序：0～20 min，95%A；20～55 min，95%A→60%A；55～60 min，60%A→50%A；55～60 min，50%A→95%A；65～70 min，95%A。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過 3 號(hào)篩)約2 g(精確至0.001 g)，置于25 mL容量瓶中，加入20 mL 60%甲醇，稱定質(zhì)量，渦旋混勻1 min，超聲提取40 min(40 ℃)，冷卻，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，靜置，取適量上清液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱定各對(duì)照品適量，加 10%甲醇水配制成含腺苷 2.178 0 mg·mL-1、天麻素 2.948 1 mg·mL-1、對(duì)羥基苯甲醇 2.763 3 mg·mL-1、巴利森苷 A 1.978 0 mg·mL-1、巴利森苷 B 2.536 6 mg·mL-1、巴利森苷 C 2.009 1 mg·mL-1、巴利森苷 E 2.632 6 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確量取混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，置10 mL量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，搖勻，制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照色譜條件依次進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明7種組分質(zhì)量濃度在表中的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)6次測(cè)定，記錄各組分峰面積，計(jì)算腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E7種組分峰面積的RSD分別為1.1%、0.87%、0.89%、0.91%、0.97%、1.71%、1.57%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下制備同一批號(hào)天麻的供試品溶液6份進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)當(dāng)日的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算7種組分含量，其RSD分別為1.7%、1.9%、1.2%、1.6%、1.5%、1.8%、1.7%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取天麻樣品0.5 g，精密稱定，分別加入7種相應(yīng)組分，制備6份加標(biāo)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)樣品待測(cè)溶液進(jìn)行分析，根據(jù)當(dāng)日的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算加標(biāo)樣品的測(cè)得量，求得回收率。

表3 加標(biāo)回收率(n=6)

2.8 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 考察在本文色譜條件下，對(duì)天麻樣品和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，7種組分均能達(dá)到基線分離，且分離度大于1.5，結(jié)果見圖1。

A.對(duì)照品溶液；B.樣品圖1 天麻的對(duì)照品和樣品圖譜

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果 按上述試驗(yàn)方法對(duì)25批天麻樣品和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，結(jié)果如表4。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)考察了回流提取法、超聲提取法兩種提取方法，同時(shí)比較了甲醇、乙醇以不同濃度提取，發(fā)現(xiàn)60%甲醇渦旋后超聲提取不僅簡(jiǎn)便快速而且提取效果最佳，7種組分峰面積最大，提取最完全。在提取時(shí)間方面分別考察了超聲提取30、40、50 min，發(fā)現(xiàn)提取40 min 7組分面積和提取50 min基本相當(dāng)，但是提取30 min面積相對(duì)小些。故本試驗(yàn)最終選擇采用渦旋后用60%甲醇超聲提取40 min的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。在流動(dòng)相考察方面對(duì)甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水3 個(gè)流動(dòng)相進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸水水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫各色譜峰分離度較好，7組分含量在檢測(cè)波長(zhǎng) 220 nm 檢測(cè)條件下，可實(shí)現(xiàn)完全分離。

表4 樣品中含量測(cè)定結(jié)果(%)

本文建立了采用HPLC法同時(shí)測(cè)定天麻中 7 種化學(xué)成分的含量，該方法前處理簡(jiǎn)單，采用梯度洗脫各成分分離度較好，測(cè)定靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度等均滿足測(cè)定要求，本方法為天麻的全面質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。