利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建S100A8基因敲除的CNE2細(xì)胞系

孟盈，楊建宇，歐陽(yáng)春，黃元姣

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

0 引言

鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，根據(jù)國(guó)際癌癥研究所（IARC）數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)鼻咽癌發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[1]，且鼻咽癌預(yù)后相對(duì)較差，生存率相對(duì)較低，多發(fā)于我國(guó)兩廣地區(qū)。S100A8蛋白是鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族的主要成員，常與S100A9蛋白以鈣離子依賴的方式形成異源二聚體發(fā)揮作用，參與炎癥反應(yīng)。近年來(lái)研究表明S100A8/A9在具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移以及凋亡的作用，有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，具有非常廣闊的研究前景[2]。根據(jù)本課題組前期研究，S100A8/A9蛋白對(duì)人鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE2的侵襲遷移有促進(jìn)作用[13]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用CRISPRCas9技術(shù)對(duì)CNE2細(xì)胞的S100A8基因進(jìn)行敲除，為研究S100A8基因在鼻咽癌細(xì)胞的侵襲遷移及作用機(jī)制提供有效的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、慢病毒、質(zhì)粒及菌株

人鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE2購(gòu)于湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)；LentiCas9-Blasticidin慢病毒購(gòu)于吉滿生物科技（上海）有限公司；LentiGuide-Puro質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)Adgene公司（www.adgene.com）；感受態(tài)大腸桿菌Stbl3購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑

RPMI-1640、0.25%-E D胰 T A酶和胎牛血清（Biological Industries公司）；Cell Counting Kit 8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本 Takara 公司）；Fast Start Universal SYBR Green Master（德國(guó)Roche公司）；GAPDH山羊抗兔一抗、Cas9蛋白山羊抗鼠一抗、HR P-抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)CST公司，S100A8山羊抗兔一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP-抗鼠IgG購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因測(cè)序與引物序列合成

本實(shí)驗(yàn)所需的引物、gRNA序列均合成于華大基因，序列測(cè)序有生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以5000個(gè)/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁12h后，將培養(yǎng)基分別替換為含殺稻瘟菌素（Blasticidin）0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL 的完全培養(yǎng)基100μl，對(duì)照組加入等體積的不含殺稻瘟菌素（Blasticidin）的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于5%CO2、37℃飽和濕度下培養(yǎng)48h后，吸出含藥培養(yǎng)基，PBS沖洗后，每孔加入100μl RPMI 1640培養(yǎng)基與10μL CCK-8孵育120min，于450nm測(cè)定其吸光度（A）值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率。

抑制率=1-A加藥/A對(duì)照1.4.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以3500個(gè)/孔的密度接種在69孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁12h后，按照MOI=30，用含慢病毒的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒滴度為＞107TU/mL），同時(shí)加入適量的Polybrene助轉(zhuǎn)試劑。感染后72h棄含病毒的培養(yǎng)基，更換為含殺稻瘟菌素4μg/mL的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后，棄含殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞覆蓋整個(gè)孔底，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)Cas9蛋白表達(dá)情況

收集長(zhǎng)勢(shì)良好且鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底95%的已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，取未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做對(duì)照組。提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用表中所示引物進(jìn)行熒光定量分析，反映程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；95℃15s；60℃ 1min；循環(huán)40次。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△Ct計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)水平。見(jiàn)表1。

1.4.4 Western Blot驗(yàn)證Cas9蛋白表達(dá)情況

收集長(zhǎng)勢(shì)良好且鋪滿瓶底95%的細(xì)胞，取未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做對(duì)照組。各組用冷PBS沖洗3次離心，加入細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑、EDTA、PSFM），置于冰上裂解30min后，收集于離心管，低溫離心后取上清懸液，稀釋30倍后用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取30μg，按照正常步驟做Western blotting實(shí)驗(yàn)。用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描并觀察結(jié)果。

1.4.5 gRNA的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)S100A8的基因序列（NC_000001.11），利用在線gRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://www.chopchop.cbu.uib.no/）設(shè)計(jì)針對(duì)S100A8基因的gRNA，引物序列如表2所示。在正義鏈模板的5‘端添加CACCG，反義鏈模板的5’端添加AAAC，使其可與BsmbI酶切后形成的粘性末端互補(bǔ)。將合成好的gRNA經(jīng)過(guò)磷酸化、退火后形成雙鏈DNA。見(jiàn)表2。

1.4.6 載體構(gòu)建

將Lentiguide-Puro空質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶BsmbI進(jìn)行酶切后產(chǎn)生一長(zhǎng)（約9000bp）一短（約2200bp）兩條片段，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收較長(zhǎng)酶切產(chǎn)物。通過(guò)T4連接酶將退火磷酸化后的gRNA產(chǎn)物與酶切回收產(chǎn)物連接得到連接產(chǎn)物。通過(guò)熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入stbl3感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將加入連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞均勻混入不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，200rpm/min搖菌1h后，3000g離心2min，棄部分上清，保留100μl培養(yǎng)基，輕柔混勻后涂布于含2%氨芐青霉素的平板中篩選。24h后挑取5～6個(gè)長(zhǎng)出的單克隆，搖菌16小時(shí)后，取800μl菌液凍存， 500μl用于進(jìn)一步測(cè)序鑒定，測(cè)序引物為U6通用引物。其余菌液提取質(zhì)粒后凍存。

1.4.7 CNE2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染過(guò)病毒的CNE 2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。于24孔板中每孔接種1.5X105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%-70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以等量空白載體Lentiguide-Puro為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染前30min更換為無(wú)雙抗的培養(yǎng)基，每孔加750μl培養(yǎng)基（10%FBS+1640）。取一1.5mLEP管標(biāo)記為1號(hào)，取重組質(zhì)粒 2μg，稀釋到 100μL Opti-MEM中，靜置5min；另取一1.5mLEP管標(biāo)記為2號(hào)，取4μl LP3000，稀釋到100μL Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中。將2號(hào)管中的液體吸至1號(hào)管中，混勻，室溫靜置20min。等待的20min中將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出，將培養(yǎng)基換成含有10%FBS的培養(yǎng)基。將1號(hào)管中的混合液體迅速加入到準(zhǔn)備好的24孔板細(xì)胞中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)基更換為含嘌呤霉素（10μg/mL）和10%FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。同時(shí)用等量的LentiGuide-Puro空白質(zhì)粒做陰性對(duì)照。

表1 引物序列信息

表2 gRNA序列信息

1.4.8 敲除S100A8基因的CNE2細(xì)胞單克隆篩選及鑒定

更換培養(yǎng)基后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過(guò)稀釋至80個(gè)細(xì)胞/mL，然后接種到96孔板上，100μL/孔。顯微鏡下觀察并標(biāo)記只有一個(gè)細(xì)胞的孔，每天觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。待到其細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板培養(yǎng)3-5天，待其細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，將其轉(zhuǎn)至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。取部分細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的S100A8蛋白是否表達(dá)，從而判斷S100A8基因是否敲除成功。

2 結(jié)果

2.1 抑制率曲線繪制

分別將不同濃度的殺稻瘟菌素作用于CNE2細(xì)胞，檢測(cè)其濃度在0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率。如圖1所示，當(dāng)藥物濃度為1μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到95%，因此后續(xù)篩選濃度選擇 2μg/mL。

圖1 殺稻瘟菌素對(duì)CNE2生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果驗(yàn)證

正常細(xì)胞內(nèi)Cas9蛋白幾乎無(wú)表達(dá)，慢病毒轉(zhuǎn)染成功后細(xì)胞才可以表達(dá)Cas9蛋白，經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)Cas9蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，如圖2。因此可在基因?qū)用孀C明已成功構(gòu)建可表達(dá)Cas9蛋白的CNE2細(xì)胞株。

圖2 轉(zhuǎn)染后CNE2細(xì)胞內(nèi)Cas9蛋白表達(dá)情況

2.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CNE2細(xì)胞的Cas9蛋白表達(dá)情況

進(jìn)一步從蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。如圖3，與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的CNE2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后的CNE2細(xì)胞檢測(cè)到Cas9蛋白表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

圖3 A：Westernblot檢測(cè)細(xì)胞株中Cas9蛋白表達(dá)情況；B：細(xì)胞株中Cas9蛋白表達(dá)灰度值

2.4 Lentiguide-Puro-S100A8-sg載體構(gòu)建后的驗(yàn)證

如圖4所示，測(cè)序結(jié)果顯示，靶向S100A8基因的gRNA序列成功連入Lentiguide-Puro載體，證明Lentiguide-Puro-sg載體構(gòu)建成功。

圖4 編輯S100A8基因的Lentiguide-Puro-S100A8-sg質(zhì)粒載體測(cè)序結(jié)果

2.5 S100A8基因敲除驗(yàn)證

分別與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CNE2細(xì)胞系、只轉(zhuǎn)染慢病毒的CNE2細(xì)胞系、轉(zhuǎn)染慢病毒與空白質(zhì)粒的CNE2細(xì)胞系比較，轉(zhuǎn)染慢病毒與攜帶sgRNA的質(zhì)粒的CNE2細(xì)胞系不表達(dá)S100A8蛋白，說(shuō)明S100A8基因敲除成功。見(jiàn)圖5。

CNE2-T: 只轉(zhuǎn)染病毒的CNE2細(xì)胞；CNE2-LG：轉(zhuǎn)染病毒與空白質(zhì)粒的CNE2細(xì)胞；CNE2-sg: 轉(zhuǎn)染慢病毒與gRNA質(zhì)粒的CNE2細(xì)胞圖5 A: Westernblot檢測(cè)細(xì)胞株中S100A8蛋白的表達(dá)情況；B：細(xì)胞株中S100A8蛋白表達(dá)灰度值

3 討論

S100A8（calgranulin，MRP8）是鈣離子結(jié)合蛋白S100蛋白家族的成員之一，通常與S100A9通過(guò)化學(xué)結(jié)合形成異源二聚體從而發(fā)揮作用。研究表明，S100A8/A9具有抗炎作用，在炎癥反應(yīng)中，S100A8易被氧化從而消耗部分氧化物，可保護(hù)組織不被氧化，發(fā)揮抗炎作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，S100A8/A9在某些惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)，如結(jié)直腸癌、胃癌等[4,5]。

CRISPR-Cas9是一項(xiàng)近年來(lái)興起的基因編輯技術(shù)，可以對(duì)基因組進(jìn)行精準(zhǔn)、高效的敲除[6]。它通過(guò)gRNA與Cas9核酸酶識(shí)別不同的外源DNA序列，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行切割，使斷裂后的DNA進(jìn)行插入缺失、修復(fù)或者替換[7-11]。我們發(fā)現(xiàn)，S100A8蛋白和S100A9蛋白在鼻咽癌患者血漿、鼻咽癌組織以及培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)水平均高于正常人[12]，研究表明，通過(guò)siRNA沉默S100A8、S100A9基因后，鼻咽癌細(xì)胞的侵襲遷移能力受到影響[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用CRISPR-Cas9技術(shù)，對(duì)鼻咽癌低分化CNE2細(xì)胞系S100A8基因進(jìn)行切割，使得S100A8基因雙鏈斷裂后形成錯(cuò)配，從而達(dá)到敲除S100A8基因的目的。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，首先使CNE2細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白。通過(guò)Westernblot與RT-PCR結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染，CNE2細(xì)胞已可以穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白。通過(guò)測(cè)序結(jié)果可以看到，gRNA已成功連接到Lentiguide-Puro載體上，證明我們已成功構(gòu)建了Lentiguide-Puro-sg載體。通過(guò)Westernblot結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，CNE 2細(xì)胞中S100A8蛋白已不再表達(dá)，說(shuō)明S100A8基因已成功敲除，CNE2-sg構(gòu)建成功。但是本實(shí)驗(yàn)中仍存在一些不足之處，比如CRISPR-Cas9技術(shù)目前僅限于理論研究層面，并未真正用于臨床實(shí)際應(yīng)用，且該技術(shù)存在一定的脫靶效率，安全性與穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步分析。

綜上所述，本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了S100A8基因敲除的CNE2細(xì)胞系，為S100A8基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞侵襲遷移以及增殖凋亡中的作用研究提供了有力工具。