樹鼩肺成纖維細胞的分離、鑒定和傳代培養

王文廣， 匡德宣， 陸彩霞， 罕園園， 李 娜， 仝品芬， 孫曉梅， 代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心、云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室、云南省眼科疾病防治研究重點實驗室、中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創新團隊， 昆明 650118)

樹鼩是一種新開發的極具潛力的實驗動物資源，與靈長類動物的進化關系比嚙齒類動物更接近，其免疫系統、神經系統中關鍵調節因子和信號通路與非人靈長類動物及人類有很高的同源性、保守性，并有其獨特的特征[1]，因此越來越受到科研人員的重視。人們先后利用樹鼩在病毒感染、腫瘤、內分泌、神經和視覺等方面進行了深入的研究，也成功建立了多種病毒感染樹鼩的動物模型，樹鼩有望在許多方面作為非人靈長類的替代動物而被廣泛應用于生命科學研究[2]。

同時，基于樹鼩細胞水平的體外研究也逐漸發展，目前文獻報道的包括樹鼩的原代肝細胞[3]、肝枯否細胞[4]、海馬神經干細胞[5]、腦星形膠質細胞[6]、淋巴細胞[7]、角膜上皮細胞[8]和骨髓間充質干細胞[9]等成功分離培養和應用，一方面可在盡量減少個體差異干擾的情況下對體內模型起到補充驗證作用，另一方面也為各種疾病相關機制的探討和藥物的篩選提供了很好的體外實驗平臺。

本研究嘗試建立一套樹鼩肺成纖維細胞的分離、鑒定和傳代培養方法，以期為因環境問題而日漸高發的各種肺病或其他感染性疾病研究提供新的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

經人工繁育幼齡樹鼩，來自中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心[SCXK(滇)K2018-0002]，飼養于普通環境[SYXK(滇) K2018-0002]。對照用人胚肺二倍體成纖維細胞(KMB-17)，來自中國醫學科學院醫學生物學研究所。

1.2 主要儀器及試劑

倒置熒光相差顯微成像系統(ECLIPSE)購自日本尼康公司，CO2培養箱購自美國Thermo 公司，PowerWave XS2微孔板分光光度計購自美國BioTek公司，DMEM培養基和胰蛋白酶購自美國HyClone公司，胎牛血清購自以色列BI 公司，MTS 一步法細胞活力檢測試劑盒購自美國Pr omeg a 公司，Vimentin 波形蛋白抗體購自德國Merck Millipore 公司，DMSO 購自美國Solarbio 公司，一步法細胞凍存液Ori CellTMNCR Protein-Free Cryopreservation Medium 購自美國Cyagen 公司。

1.3 方法

1.3.1 樹鼩肺組織取材 選取新生2 d左右被母樹鼩棄養的幼樹鼩，注射1 mL 質量分數為1%戊巴比妥鈉過量麻醉處死； 先以體積分數75%酒精浸泡消毒，再用含體積分數1%雙抗的PBS 沖洗一次，剪開胸腔，取出肺組織，剔除胸膜以及氣管、支氣管和血管較為集中的肺組織，PBS 沖洗3 次后剪成1 mm3組織小塊備用。

1.3.2 組織塊貼壁法培養樹鼩肺成纖維細胞 用一次性巴氏吸管將1.3.1 中肺部組織小塊轉入25 cm2細胞培養瓶中，均勻分布，靜置2～3 min 后輕輕翻轉培養瓶，加入3 mL 含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養液，于CO2培養箱中37 ℃倒置培養1～2 h，待組織塊貼牢后輕輕翻轉培養瓶正置培養。培養期間根據生長情況更換培養液，使用倒置顯微鏡觀察拍照。

1.3.3 酶消化法培養樹鼩肺成纖維細胞 取1.2.1中所得肺組織小塊，按約1∶5 的體積比例加入質量分數0.1%胰酶， 37 ℃下振蕩消化約20 min， 至大部分組織塊消化為細胞懸液； 加入等體積的DMEM完全培養液(含體積分數10%胎牛血清)，終止消化；1 200 r/min 離心5 min，棄上清； 加入4 mL DMEM完全培養液重懸， 轉入25 cm2培養瓶中， 于CO2培養箱中37 ℃培養過夜； 第二日倒去培養液并用PBS洗去組織小塊和未貼壁細胞， 加完全培養基繼續培養。

1.3.4 樹鼩肺成纖維細胞的傳代培養 對原代培養的樹鼩肺細胞進行定期觀察，當細胞鋪滿瓶底80%左右面積即可進行首次傳代，經PBS 潤洗后，加質量分數0.25%胰酶消化，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM 完全培養液終止，并按照1∶2 進行傳代培養，定期觀察拍照。采用差速貼壁法進行純化，即消化傳代的細胞37 ℃貼壁培養3 h 左右，倒掉培養液并用PBS 潤洗以除去未貼壁細胞，然后補足完全培養液繼續培養。

1.3.5 樹鼩肺成纖維細胞的免疫熒光鑒定 消化第二代樹鼩肺細胞接種至12 孔板，培養2 d 待其大部分長成細胞單層，PBS 清洗2 次， 使用質量分數4%的多聚甲醛溶液固定20 min； PBS 清洗3 次， 用質量分數0.5%的Triton-X100 穿孔15 min； PBS 漂洗3 次， 山羊血清封閉液封閉30 min； PBS 漂洗3次，加入經質量分數3%的BSA 稀釋的小鼠源Vimentin一抗(1∶500)進行孵育，4 ℃過夜； PBS 漂洗3 次，加入經質量分數1%的BSA 稀釋的熒光標記的兔抗鼠IgG 二抗(1∶500)，37 ℃避光孵育1 h； 暗光環境中，PBS 漂洗3 次，滴加DAPI 避光孵育2 min，對標本進行染核； PBS 漂洗3次，洗去多余的DAPI；在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.3.6 樹鼩肺成纖維細胞的凍存和復蘇 選取狀態良好的第三代樹鼩肺成纖維細胞，分別采用DMSO 和一步法細胞凍存液NCR Protein-Free Cryopreservation Medium 進行細胞的凍存。分別復蘇細胞，通過形態觀察和細胞生長曲線的繪制來評價細胞復蘇后的活力。

DMSO凍存法： 取約90%長滿瓶底的樹鼩肺成纖維細胞，質量分數0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養液吹打制成細胞懸液，移至15 mL 離心管中； 1 200 r/min 離心5 min，吸棄上清； 加入含體積分數10%DMSO的細胞凍存液重懸細胞，轉入細胞凍存管中，細胞密度控制在105/mL～106/mL； 將封好的凍存管于4 ℃放置15 min，然后轉入-20 ℃放置30 min，再轉入-80 ℃過夜，之后放入液氮長期保存。

一步法細胞凍存： 前期操作同DMSO法， 消化細胞， 制成細胞懸液， 移至15 mL離心管中； 1 200 r/min離心5 min，吸棄上清； 加入一步法細胞凍存液NCR Protein-Free Cryopreservation Medium， 重懸細胞， 轉入細胞凍存管中，細胞密度控制在105/mL～106/mL；將封好的凍存管直接轉入-80 ℃冰箱，24 h 后轉入液氮長期保存。

細胞復蘇： 將細胞凍存管從液氮中取出后，立即放入37℃左右的溫水中，不斷晃動，使其迅速完全融化； 用體積分數75%乙醇消毒凍存管表面后移至超凈工作臺，用加樣槍將細胞懸液轉至15 mL離心管中，1 200 r/min 離心5 min，棄上清； 用適量DMEM 完全培養液重懸細胞，轉入細胞培養瓶內，于CO2培養箱中37 ℃培養觀察； 另留取適量復蘇細胞重懸液臺盼藍染色，通過細胞計數，計算細胞的存活率。

1.3.7 細胞生長曲線 選擇連續傳代培養的和經兩種方式凍存復蘇處理的第4代樹鼩肺成纖維細胞為對象，以KMB17 為對照，按MTS 法連續7 d 測定細胞活力，繪制細胞的生長曲線。貼壁完全樹鼩肺成纖維細胞，以質量分數0.25%胰酶消化后制備密度為5×104/mL 的細胞懸液，按每孔200 μL接入96 孔板，體積分數5% CO2培養箱中37 ℃連續培養7 d，每2 d 換液1 次； 每隔24 h，對照組、空白組和實驗組各取3 個復孔，每100 μL 培養液加入20 μL CellTiter 96?A Queous One Solution Reagent，孵育2 h 后，分光光度計讀取490 nm 波長下的吸光度(A)值； 連續測定7 d 后，根據培養時間和對應的吸光度值繪制各細胞的生長曲線。

2 結果

2.1 樹鼩肺細胞的原代培養

組織塊貼壁法培養樹鼩原代肺細胞，2 d 左右可見細胞從肺組織塊周邊遷出，隨后不斷擴大范圍，一般培養7 d 左右新生細胞可以鋪滿培養瓶底約80%的面積，培養6 d 的細胞形態見圖1A，多數成纖維狀； 胰酶消化法培養周期相對較短，2 d左右可見基本長滿瓶底，細胞形態多呈現為梭形(圖1B)； 兩種方法均可培養出樹鼩原代肺細胞， 并且多數細胞均呈梭形，與KMB-17(圖1C)大致相似。

2.2 樹鼩肺細胞傳代培養

樹鼩肺細胞經過原代培養形成細胞單層后，即可進行傳代，通過差速貼壁法進行純化，培養2 d 可見形成的細胞單層普遍表現出纖維狀形態，連續進行4 次傳代，在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態基本能夠保持一致(圖2)，但成纖維細胞的純度尚需進一步的鑒定。

圖1 樹鼩原代肺細胞培養形態Figure 1 Culture morphology of primary pulmonary cells of tree shrew

圖2 樹鼩肺細胞傳代培養形態 (2 d)Figure 2 Subculture morphology of tree shrew pulmonary cells (2 d)

2.3 樹鼩肺成纖維細胞的鑒定

使用波形蛋白抗體Vimentin對培養的第3代樹鼩肺細胞進行免疫熒光鑒定，以KMB-17細胞為對照，如圖3 所示，可見樹鼩肺細胞波形蛋白普遍呈現綠色熒光，證明所培養細胞為成纖維細胞，純度比例高達95%以上。

2.4 樹鼩肺成纖維細胞的凍存與復蘇

樹鼩肺成纖維細胞的凍存分別采用了傳統的DMSO 法和一步法細胞凍存液NCR Protein-Free Cryopreservation Medium進行， 分別對復蘇細胞計數，計算出DMSO法凍存復蘇后細胞存活率77.5%，一步法試劑凍存復蘇后細胞的存活率為82%。細胞復蘇后24 h 的形態見圖4，可以看出兩種方法凍存的細胞均能順利恢復，并保持均一的成纖維細胞形態，而具體的細胞活力則通過細胞生長曲線的繪制來評價。

2.5 細胞生長曲線

MTS 法連續7 d 測定細胞活力，根據490 nm波長下的吸光度值繪制出細胞生長曲線如圖5所示，可以看出各細胞生長狀態大致呈現出經典的S 型，先經過1～2 d 恢復期，在3～4 d 開始迅速增殖，基本從第5 日開始維持在一個平臺期，與正常連續傳代的細胞相比，復蘇后的樹鼩肺成纖維細胞仍保持著良好的細胞活力，DMSO和一步法凍存液的凍存復蘇效果基本一致。

3 討論

肺臟是呼吸系統的主要器官，大多數呼吸系統疾病的發展都與肺部密切相關，樹鼩也曾先后被應用于各種人類呼吸系統疾病的研究。肺癌是目前死亡率最高的惡性腫瘤之一，陳小波等[10]應用宣威煙煤粉塵PM10 對樹鼩行氣管內灌注，研究表明宣威煙煤粉塵可以導致樹鼩支氣管上皮出現支氣管粘膜上皮過度增生-鱗狀化生-不典型增生-早期侵潤癌的病理變化，有望利用樹鼩建立宣威煙煤粉塵致肺癌模型。甲型H1N1 流感曾在全球范圍內大規模流行，研究[11]表明人的H1N1 流感病毒可在樹鼩的上呼吸道復制，使其表現出輕微或中度的呼吸道癥狀及呼吸道的病理變化，廣泛分布于氣管和鼻黏膜的受體是sialic acid (SA)a2，6-gal，而肺組織中的主要受體是(SA)a2，3-gal。

圖3 樹鼩第3 代肺成纖維細胞的免疫熒光鑒定Figure 3 Immunofluorescence identification of the third generation pulmonary fibroblasts of tree shrew

圖4 復蘇后的樹鼩肺成纖維細胞形態(24 h)Figure 4 Morphology of tree shrew pulmonary fibroblasts after recover (24 h)

圖5 樹鼩肺成纖維細胞生長曲線Figure 5 Growth curve of tree shrew pulmonary fibroblasts

樹鼩肺部細胞的分離培養及體外感染模型的建立，對相關疾病的發病機制研究或藥物篩選具有重要應用價值。成纖維細胞是肺組織中重要的間質細胞，主要功能是參與肺臟的組織構架、合成和分泌胞外基質以及修復損傷組織等[12]。肺成纖維細胞是體外研究慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等肺部相關疾病的重要實驗材料，其常見的分離培養方法有組織塊貼壁法[13]和酶消化法[14]。本研究采用上述兩種主流方法對樹鼩肺成纖維細胞進行分離培養，鑒于肺組織中有大量的血管和毛細血管、氣管和支氣管以及肺泡等，這些材料均會影響成纖維細胞的培養純度，因此在進行組織取材時，優先剪取各葉肺邊緣區域組織，盡量避開核心區域比較密集的血管和氣管。組織塊貼壁法培養2 d 后可觀察到細胞從組織塊周邊遷出，7 d 左右細胞可大體鋪滿培養瓶底，胰酶消化法則在3 d 左右即可觀察到細胞基本鋪滿瓶底，兩者均以成纖維狀細胞為主，與人胚肺二倍體成纖維細胞KMB-17 相似。培養過程中，不同細胞的貼壁時間不一樣，成纖維細胞貼壁最快，而且經胰酶消化時也較易脫落，因此，可利用差速貼壁法對肺成纖維細胞進行純化。傳代時消化時間不要過久，2 min 左右為宜，及時終止消化并吹打細胞，對胰酶不太敏感的細胞則滯留在培養瓶底； 細胞貼壁培養2 h 左右，進行換液，除去貼壁慢的其他細胞，如此進行2 ～3 次重復即可實現純化。

成纖維細胞特異表達波形蛋白，本研究使用小鼠源的波形蛋白抗體Vimentin對培養的第3代樹鼩肺細胞進行免疫熒光鑒定，同樣以KMB-17為對照，樹鼩肺成纖維細胞普遍呈現綠色熒光，其純度在95%以上，證明實驗中所采用的樹鼩肺成纖維細胞分離培養和純化方法是可行的。

樹鼩肺成纖維細胞使用含10% 胎牛血清的DMEM 培養液， 可連續進行傳代4～5 次，第4～5 代細胞保持均一形態，生長旺盛，可用來開展相關實驗。傳至第6 代以后，細胞形態開始變化，有不規則的空泡狀細胞出現，而且生長速度變慢，長滿單層時間延長，不能繼續傳代，因此，需要及時對狀態良好的樹鼩肺成纖維細胞進行凍存。本研究選取第3 代樹鼩肺成纖維細胞，分別采用傳統的DMSO和一步法凍存試劑進行了細胞的凍存與復蘇實驗，通過形態觀察和生長曲線繪制進行活力評價，表明兩種方法均可有效凍存細胞，細胞復蘇后可仍保持良好的活力，其中一步法凍存試劑操作便捷，省時省力，可有效減少人為操作的誤差，比較適合樹鼩肺成纖維細胞的凍存。