ELISA法與免疫膜條法檢測抗MDA5抗體、抗TIF1γ抗體的比對分析

李柳冰，劉晨曦，張艷芳,2，程琳琳，晏頌欣，李永哲△

(1.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京 100730；2.吉林大學第一醫院檢驗科，吉林長春 130021)

皮肌炎(DM)是以對稱性四肢近端肌無力為特征表現的異質性疾病，女性患者居多[1]。肌炎特異度自身抗體(MSAs)與疾病臨床分型、臨床特征相關，可有效輔助皮肌炎的診斷和預后評估[2-4]。免疫膜條法能有效快速地進行多個自身抗體的檢測，在臨床檢測中的應用越發廣泛。然而，有研究指出[5]，采用免疫膜條法檢測自身抗體，會出現以下情況：(1)多個自身抗體出現假陽性；(2)免疫膜條法對自身抗體(如抗Jo-1抗體)的檢測結果與其他方法(如免疫沉淀法)得到的檢測結果存在較大不一致情況?；诖?，本文分別用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法和免疫膜條法檢測皮肌炎患者血清中的兩種MSAs：抗黑色素瘤分化相關基因5(MDA5)抗體和抗轉錄中介因子 1γ(TIF1γ)抗體，探討這兩種方法檢測抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體結果的差異性。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入的180例皮肌炎患者，來源于北京協和醫院和衛生行業科研專項資助下的多家醫院。其中男59例，女121例，年齡2～76歲，平均(43.40±18.64)歲。皮肌炎中包括經典皮肌炎(CDM)100例，無肌病性皮肌炎(CADM)11例，幼年型皮肌炎(JDM)29例，皮肌炎合并惡性腫瘤(CAM)40例。CDM和JDM患者均符合1975年Bohan/Peter診斷標準[6-7]，且JDM的發病年齡<18歲。CADM患者符合Sontheimer診斷標準[8]。CAM患者中對于惡性腫瘤的診斷均符合相應臨床診斷標準。同時，排除合并其他自身免疫性疾病的皮肌炎患者。本研究已獲得北京協和醫院倫理委員會批準。

1.2儀器和試劑 日本MBL公司抗MDA5抗體(批號：7873)和抗TIF1γ抗體(批號：7853)ELISA檢測試劑盒；TECAN酶聯免疫檢測儀；德國歐蒙公司抗肌炎抗體譜IgG檢測試劑盒(批號：DL1530-1601-4G)；歐蒙印記法自動操作儀；EUROLineScan歐蒙印跡法判讀軟件。

1.3方法 本研究采用的抗MDA5抗體ELISA試劑盒、抗TIF1γ抗體ELISA試劑盒及抗肌炎抗體譜IgG檢測試劑盒分別是同批號試劑。血清標本于-80 ℃低溫保存并避免了反復凍融。實驗過程中嚴格按照試劑說明書進行操作并對實驗條件、檢測儀器、實驗人員等因素進行嚴格質量控制。

1.3.1ELISA法 按照抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體ELISA檢測試劑盒說明書要求，用樣本稀釋液101倍稀釋血清樣本。在相應微孔中分別加入100 μL標準品1、標準品2、陽性對照、陰性對照和稀釋過的血清樣本。室溫(20 ℃～30 ℃)溫育30 min，洗板4次，加入100 μL酶結合物，溫育30 min，洗板4次后加入100 μL底物，溫育15 min后加入100 μL終止液。于TECAN酶聯免疫檢測儀波長在450 nm處檢測各孔吸光度值。待測樣本的濃度值(U/mL)=(待測樣品吸光度值-標準品1吸光度值)/(標準品2吸光度值-標準品1吸光度值)×100。樣本濃度>32 U/mL為陽性。

1.3.2免疫膜條法 抗肌炎抗體譜IgG檢測試劑盒包含抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體。將檢測膜條放入溫育槽中，并在每槽中加入1.5 mL樣本緩沖液，搖床溫育5 min。吸去緩沖液，在每槽中加入1.5 mL 經101倍稀釋血清樣本。搖床溫育30 min后，清洗3次，每次5 min。隨后，在每槽中加入1.5 mL酶結合物，搖床溫育30 min后清洗3次。再在每槽中加入1.5 mL底物，搖床溫育10 min后，吸去液體，蒸餾水清洗3次。于歐盟印跡法自動操作儀(EUROBlotMaster)檢測結果。著色強度>15為陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。同時進行Kappa一致性分析，以P<0.01認為兩種方法的一致性具有統計學意義。Kappa值≥0.75，為一致性好；Kappa值在0.40～<0.75，為一致性一般；Kappa值<0.40為一致性差。

2 結 果

2.1ELISA法和免疫膜條法的檢測結果 如表1所示，抗MDA5抗體用ELISA法和免疫膜條法檢測的陽性率分別為29.44%和27.78%，差異無統計學意義(P=0.726)?？筎IF1γ抗體用ELISA法和免疫膜條法檢測的陽性率分別為28.33%和20.56%，差異無統計學意義(P=0.086)。

表1 兩種方法檢測抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體陽性率的比較

2.2ELISA法和免疫膜條法對抗MDA5抗體檢測結果的符合情況 如表2所示，180例樣本中，ELISA法檢測出53例抗MDA5抗體陽性皮肌炎患者，其中有39例免疫膜條法檢測結果與ELISA法相符，陽性符合率為73.58%(39/53)，陰性符合率為91.34%(116/127)。兩種方法對于抗MDA5抗體檢測結果的總符合率為86.11%(155/180)。Kappa一致性檢驗：Kappa值=0.660(P<0.001)，認為兩種方法對抗MDA5抗體的檢測結果的一致性有統計學意義，但一致性一般。

2.3ELISA法和免疫膜條法對抗TIF1γ抗體檢測結果的符合情況 如表3所示，180例樣本中，ELISA法檢測出51例抗TIF1γ抗體陽性皮肌炎患者，其中有32例免疫膜條法檢測結果與ELISA法相符，陽性符合率為62.75%(32/51)，陰性符合率為96.12%(124/129)。兩種方法對于抗TIF1γ抗體檢測結果的總符合率為86.67%(156/180)。Kappa一致性檢驗：Kappa值=0.642(P<0.001)，認為兩種方法對抗TIF1γ抗體的檢測結果的一致性有統計學意義，但一致性一般。

表2 兩種方法對抗MDA5抗體檢測結果的比較(n)

表3 兩種方法對抗TIF1γ抗體檢測結果的比較(n)

3 討 論

抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體均為皮肌炎特異度抗體，對皮肌炎的診斷具有重要意義?？筂DA5抗體最先于日本皮肌炎患者的血清中發現，該抗體陽性患者具有典型的皮膚受累如手掌丘疹、皮膚潰瘍，且發生快速進展型肺間質病變的風險增加[9]。靶抗原MDA5是一種維甲酸誘導基因I樣受體，參與抗病毒先天免疫防御，可識別出柯薩奇病毒、鼻病毒、登革熱病毒和牛痘病毒等病毒類型[9]。LI等[10]對628例皮肌炎患者組與221例健康對照組進行meta分析，結果發現抗MDA5抗體與皮肌炎相關，尤其是與CADM密切相關。抗MDA5抗體對CADM診斷的合并靈敏度是62%(95%CI：52%～70%)，合并特異度是100%(95%CI：97%～100%)，綜合受試者工作特征曲線下面積是0.94?？筎IF1γ抗體最早于2006年報道，在成年皮肌炎患者中的陽性率是20%～30%，在JDM患者中的陽性率為30%～40%[11-12]。靶抗原TIF1γ發揮轉錄調節、腫瘤抑制、DNA損傷修復等功能[13]。抗TIF1γ抗體與皮肌炎合并惡性腫瘤密切相關，抗TIF1γ抗體陽性患者中，超過50%患者會出現惡性腫瘤[3,14]?？梢娍筂DA5抗體和抗TIF1γ抗體是皮肌炎診斷和鑒別診斷不可忽視的輔助手段。

目前，檢測皮肌炎自身抗體多采用ELISA法和免疫膜條法。免疫膜條法由于具有簡便快速等優勢，越來越多地應用于臨床檢測中。然而，文獻報道指出，免疫膜條法存在一些弊端。HAMAGUCHI等比對免疫沉淀法和免疫膜條法對抗OJ抗體檢測結果的差異性[15]。9例用免疫沉淀法證實有抗OJ抗體存在的血清，用免疫膜條法的檢測結果均為陰性；52例用免疫沉淀法證實不存在抗OJ抗體的血清，用免疫膜條法的檢測結果均為陰性。免疫膜條法對抗OJ抗體的靈敏度為0%，特異度為100%。CAVAZZANA等比對免疫沉淀法和免疫膜條法對抗Mi-2α、Mi-2β、TIF1γ、MDA5、NXP2、SAE、Ku、PM-Scl75、PM-Scl100、SRP、PL-7、PL-12、EJ、OJ、Jo-1抗體檢測結果的一致性[5]。研究顯示，兩種方法對抗TIF1γ抗體、抗MDA5抗體和抗NXP2抗體檢測的一致性好，對抗Mi-2α/β抗體和抗EJ抗體檢測的一致性一般，對抗Jo-1抗體檢測的一致性差。

前期，本研究采用的抗TIF1γ抗體ELISA試劑盒的檢測結果與金標準免疫沉淀法進行了比對[16]，ELISA法的敏感度和特異度均為100%。本文采用ELISA法和免疫膜條法檢測皮肌炎患者血清中的抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體，并對兩種方法的檢測結果進行比對分析，結果表明，ELISA法和免疫膜條法對抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體檢測的一致性一般。本研究及前期研究結果顯示，免疫膜條法與ELISA法、免疫沉淀法的檢測符合度并不十分一致。可見，盡管這3組方法都能檢測自身抗體，相對于操作要求不高，省時快捷的免疫膜條法，ELISA法和免疫沉淀法檢測結果更準確。因此，當遇到免疫膜條法檢測的自身抗體結果和患者臨床特征不符的情況時，可采用ELISA法或免疫沉淀法對患者血清標本進行重新檢測，從而確認檢測結果，更好發揮自身抗體檢測對臨床的價值。

在本研究中，ELISA法和免疫膜條法結果不完全一致可能是由于免疫膜條法本身的缺陷所致，如膜條法上重組抗原純度不夠或者失效，導致免疫膜條法假陰性結果的出現；此外，也可能是由于實驗環境因素(如溫度)的影響。有研究指出[17]，免疫膜條法對溫度敏感，尤其是對于弱陽性和陰性的標本，隨著實驗環境溫度的升高，膜條的顯色加深，從而導致假陽性結果的出現?；诖?，當采用免疫膜條法進行實驗時，應先評價該方法的準確性，探討周圍環境對實驗結果的影響，從而保證檢測結果的準確性。

4 結 論

本研究結果表明，ELISA法和免疫膜條法檢測抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體的一致性程度一般。雖然免疫膜條法能有效節約時間，但仍需不斷進行改善，以提高其檢測的準確性。