乙肝病毒基因型、核苷(酸)耐藥基因突變對肝硬化、肝癌的影響

雷香菊,陳 萍#,何雪琴,姜雪強,李 毅,陳 武△

(湖北醫藥學院附屬東風醫院：1.醫學檢驗部；2.感染病科,湖北十堰 442001)

乙型肝炎病毒(HBV)是導致肝硬化、肝細胞癌(HCC)的主要原因[1]。目前全球約有2.6億慢性乙型肝炎(CHB)患者，導致每年20%～30%發展為肝硬化、HCC，約84萬人死亡。近年來的研究表明，HBV基因型可能影響CHB患者的臨床表現，以及肝硬化、肝癌的發展[2-3]；此外，核苷(酸)類藥物(NAs)是目前FDA批準的唯一抗HBV化學藥物，但易引起耐藥性基因突變，導致病毒學、生物化學突破[4-5]。然而，其對CHB患者肝臟病變的影響目前還報道較少[6]。因此，本文調查了本地HBV基因型、逆轉錄酶區主要耐藥基因突變與CHB患者肝硬化、HCC的關系，從而為預防和治療CHB提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2015年4月至2017年12月，在本地住院治療的540例HBV-DNA定量陽性(DNA拷貝數>1×103/mL)CHB患者，平均(47.8±13.1)歲。根據2015年乙型肝炎防治指南[7]，將患者分為慢性乙肝組、肝硬化代償組、肝硬化失代償組、HCC組。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染和可能導致肝臟病變的其他疾病，并記錄前期NAs用藥史。患者于住院期間清晨抽取靜脈血送醫學檢驗部，檢測HBV基因型和RT區主要耐藥基因突變，以及血清透明質酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原N端肽(PCⅢNP)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原199(CA199)水平。

1.2儀器設備 熒光定量PCR儀RG-6000(Corbett Research公司)、分子雜交儀HBHM-9000A(廣東凱普生物科技有限公司)、基因芯片閱讀儀YN2009(深圳亞能生物技術有限公司)、美國Beckman-coulter公司(DxC 600型)生化免疫一體機。

1.3檢測方法 血清肝纖維化、腫瘤標記物采用免疫化學發光法測定(美國Abbott診斷公司，500次/盒)。HBV-DNA提取和RT-PCR采用熒光定量試劑盒(廣州達安基因股份有限公司,48次/盒)；HBV基因型、耐藥基因突變類型采用巢式PCR和反向雜交法測定(深圳亞能生物技術有限公司,25次/盒)：參照試劑盒說明，在保證顯色控制點、陽性質控品正常顯色而陰性質控不顯色情況下，通過芯片閱讀儀判讀，得到HBV基因型和耐藥基因突變結果，檢測的RT區主要突變模式為M204V、M204I、L180M、A181V、V207I、N236T。

2 結 果

2.1一般性資料 收集的540例HBV-DNA 陽性CHB患者中，19例因未檢測出基因型而排除。其他521例CHB患者中，200例有CHB相關肝硬化或肝細胞癌(38.4%)，322例無肝臟病變(61.6%)。兩者間年齡差異有統計學意義，且4組年齡呈明顯遞增趨勢(F=18.059,P<0.001)；兩者間性別差異無統計學意義(P>0.05)，但男女性HCC比例差異有統計學意義(χ2=7.543,P=0.006)。此外，521例CHB患者中，272例有NAs用藥史，249例無NAs用藥史，前者肝臟病變率明顯低于后者，差異有統計學意義(表1)。

2.2基因型、耐藥基因突變與CHB肝硬化、肝癌相關性 521例CHB患者中，檢出B、C、D和BC混合基因型分別為323例(62.0%)、187例(35.9%)、3例(0.6%)和8例(1.5%)。由于D型、BC混合型例數較少，因此未計入統計分析。C基因型CHB患者中肝臟病變的比例高于B基因型，差異有統計學意義(P<0.05)。272例有NAs用藥史的CHB患者中，113例檢出RT區主要耐藥基因突變(41.5%)，突變型患者中肝臟病變的比例與野生型無統計學意義。見表2。

2.3HBV基因型、耐藥基因突變與血清肝纖維化指標的相關性 血清腫瘤標記物水平經取ln對數后均滿足正態分布，結果顯示：C基因型血清ln、PⅢPNP、Ⅳ-C水平均高于B型，差異有統計學意義(P>0.05)；血清HA水平亦高于B基因型，但差異無統計學意義(P>0.05)。在272例有NAs用藥史的CHB患者中，突變型各血清肝纖維化指標與野生型差異均無統計學意義。見表3。

表1 慢性乙肝患者的臨床分組和特征

注:*CHB合并肝臟病變患者與單純CHB患者的比較

表2 慢性乙肝患者基因型、耐藥基因突變與肝臟病變的關系[n(%)]

注:a由于D型、BC混合型例數較少未計入統計分析；b有NAs用藥史

表3 基因型、耐藥基因突變與血清肝纖維化指標的關系

注:*有NAs用藥史;-表示無數據

表4 基因型、耐藥基因突變與血清腫瘤標志物的關系

注:*有NAs用藥史;-表示無數據

2.4基因型、耐藥基因突變與血清腫瘤標記物的相關性 血清腫瘤標記物水平經取ln對數后均滿足正態分布，結果顯示：C基因型CHB患者血清AFP、CA125水平高于B基因型，差異有統計學意義(P<0.05)；血清CEA、CA199水平亦高于B基因型，但差異無統計學意義(P>0.05)。而耐藥基因突變型各血清腫瘤標記物均高于野生型，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5基因型、性別與血清腫瘤標記物的相關性 由于不同腫瘤的發生率與性別有關，因此本文分別比較了男女性B、C基因型腫瘤標記物的差異。結果表明：男性兩基因型只有AFP差異有統計學意義(P<0.05)；而女性中兩基因型AFP、CEA、CA125差異均有統計學意義(P<0.05)；而兩者CA199均無統計學意義(P>0.05)。

表5 基因型、性別與血清腫瘤標志物的關系

注：-表示無數據

3 討 論

目前根據HBV全基因組序列差異大于8%，將其分為A～J等10種基因型，且基因型呈明顯的地域分布[2]。我國北方及部分南方地區以C型為主，湖北、湖南、江西、福建、臺灣等部分地區以B型為主[8]。本地CHB住院患者中，B基因型比例高達63.9%(包括混合型)[9]，這對研究B型HBV的特點提供了良好的條件。已有的研究表明，C基因型具有較慢的血清乙型肝炎E抗原(HBeAg)轉換、對干擾素治療不敏感[6]。本文前期的研究也表明：C基因型CHB患者血清HBV-DNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、酶學水平高于B型，且更易發生NAs耐藥基因突變[9]。然而，其與肝硬化、肝癌的關系還有待調查。

已有的幾項亞洲人群的調查顯示出不一致的結果：一項對臺灣地區2 762例HBV攜帶者的調查顯示，C基因型攜帶者HCC發生率接近B型的兩倍[10]；另一項對香港地區CHB患者的調查結果也表明，C基因型是HCC獨立的風險因素[11]；然而一項對大陸地區9省1 096例HBV攜帶者的調查，卻未發現基因型與肝硬化、HCC有相關性[12]；而近年來的一項meta分析則顯示：C型HBV攜帶者發展為肝硬化、HCC的風險分別是B基因型的3.89、4.40倍[8]。本次調查的521例急性住院CHB患者，平均年齡47.8歲，排除不同HBV基因型患者間年齡、性別的差異，結果表明HBV基因型與CHB肝硬化、肝癌臨床診斷、血清標記物均有相關性，C基因型相對B基因型肝硬化、肝癌的風險更高，其OR值分別為1.34(1.04～1.73)、1.84(1.04～3.26)。幾項對日本、澳大利亞CHB患者的調查也顯示：C基因型發展為HCC的年齡更低[13-14]，提示年齡、性別、疾病狀態可能影響HBV基因型與HCC的相關性，這可能是上述結果不一致性的原因。

另一方面，NAs藥物的廣泛使用可導致耐藥基因突變，然而其對CHB患者肝硬化、肝癌的影響目前報道卻較少。本次調查結果顯示：在同樣有NAs用藥史的CHB患者中，耐藥基因突變型患者肝硬化、HCC比例與野生型差異無統計學意義，提示RT區主要耐藥基因突變與CHB肝硬化、HCC可能無相關性。盡管有研究表明：BCP區突變與HCC有關，但與RT區突變的關系目前尚不清楚[6]。此外，本次調查中還發現有NAs用藥史的CHB患者中，肝硬化、HCC比例低于無NAs用藥史患者，其OR值為0.75(0.60～0.93)，提示NAs抗病毒治療可降低肝硬化、HCC的發生率；而近來一項大型Meta分析也證實了這一點[15]。

4 結 論

總之，本次從臨床癥狀、實驗室指標兩個方面調查了521例急性CHB患者，結果表明：CHB患者肝硬化、HCC與基因型有相關性，而與逆轉靈酶區主要耐藥基因突變無相關性，且NAs用藥史與低的肝硬化、HCC發生率有關。考慮到本次調查的例數有限，且主要是住院患者，其結果還有待大規模前瞻性的研究進行證實。由于B、C基因型是我國HBV攜帶者兩種主要的基因型，因此探討其對肝硬化、HCC的影響對CHB的預防和治療具有重要意義。