1-3-β-D葡聚糖和半乳甘露聚糖檢測與血培養真菌結果的相關性分析

黃 琳，戴 瑋，張傳明，夏吉榮

(重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科,重慶 400016)

1,3-β-D-葡聚糖檢測(G試驗)和半乳甘露聚糖檢測(GM試驗)作為侵襲性真菌病(IFD)的快速實驗室指標已在臨床上廣泛應用，從報道[1-7]顯示，G試驗和GM試驗對IFD診斷的靈敏度分別在48.3%～92.0%和41.7%～95.0%，特異度分別在35.0%～88.9%和88.4%～97.0%之間，各家報道的差異較大，這是否與研究者選擇的研究對象數量，或研究病例診斷方法有關有待進一步驗證。文獻[1-7]研究病例在30～500例之間，差異較大；同時診斷IFD多以臨床診斷方式，而非無菌體液病原學真菌培養結果為“金標準”，或病理結果來確診。因而G試驗和GM試驗診斷IFD相關性研究的難點在于臨床確診“金標準”的獲得困難，為進一步探討G試驗和GM試驗在IFD診斷中的臨床價值，本文對本院2017年3月至2018年6月期間臨床疑為IFD，同時送檢G試驗、GM試驗和血培養患者的檢測結果作相關性分析，發現G試驗和GM試驗與血培養真菌結果符合率分別為92.1%，86.2%；G試驗和GM試驗聯合檢測陰性結果與血培養真菌結果符合率高達99.0%，是排除侵襲性真菌感染的特異性指標，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年3月至2018年6月間本院臨床疑為IFD患者，其中同時送檢G試驗、GM試驗和血培養的住院患者455例，男301例，女154例，平均年齡56.8歲；病例來自重癥監護室、神經內科、神經外科、呼吸內科、血液科、干細胞移植中心、老年科、腎內科、感染科、腫瘤科等。根據中國侵襲性真菌感染工作組2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則(第五次修訂版)”標準[8]：以患者病史、危險因素、可能感染的臨床特征、影像學檢查等作為疑似IFD患者同時送檢G試驗、GM試驗和血培養。其中:(1)血培養真菌結果陽性，臨床確診為侵襲性真菌感染的49例(IFD組)，男30例，女19例，年齡15～88歲。(2)血培養真菌結果陰性，臨床確診為非侵襲性真菌感染的406例(非IFD組)，男271例，女135例，平均年齡57.4歲。

1.2儀器與試劑 G試驗檢測：MB-80微生物動態快速檢測系統，Tol智能恒溫儀GKT-10MSet動態真菌檢測試劑盒和質控品，均由北京金山川科技發展公司提供。 GM試驗檢測：Sunrise酶標儀(重慶恩鳴醫療設備公司)，離心機，振蕩器。檢測試劑由美國Bio-Rad公司提供。真菌病原學檢查：法國生物梅里埃3D血培養儀、Vitek2-Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統、全自動快速微生物質譜檢測系統(MS)，美國BD公司BACTECTM FX型全自動細菌培養系統。

1.3方法

1.3.1檢測標本 用一次性無菌、無熱源真空采集管采集靜脈血3 mL，進行3 000 r/min離心10～15 min，分離血清，2 h內完成檢測。不能及時檢測的標本放置2～8 ℃冷藏，但不超過24 h。

1.3.2G試驗檢測 (1)標本前處理：取離心血清0.1 mL，加入裝有0.9 mL樣品處理液中，混勻后70 ℃孵育10 min，取出立刻放入冷卻槽冷卻5 min，為待測血清樣品。(2)用無熱源的吸頭取待測血清樣品0.1 mL，加入至9 mm×65 mm無熱平底試管中，再加入0.1 mL反應主劑溶液，混勻后插入MB-80微生物快速動態檢測系統中進行反應，反應結束后檢測系統自動計算出待測血清中1,3-β-D-葡聚糖含量。

1.3.3GM試驗檢測 (1)標本預處理：在1.5 mL聚丙烯管中加入300 μL待測離心血清和對照血清，每個試管內加入100 μL樣本處理液，混勻后用加熱器在120 ℃的溫度下加熱6 min(或在100 ℃水浴下加熱3 min)后取出再次放入離心機，離心10 min后取上清液。(2)將預處理后的待測樣本加入GM抗體包被的微孔板孵育90 min后洗滌，加入四甲基聯苯胺(TMB)底物顯色，加終止液終止反應，用酶標儀在450 mm波長下測定樣本與對照孔的OD值，通過換算公式將OD值轉化為血清學指數，血清學指數=樣本OD值/臨界值血清OD值。

1.3.4真菌病原學檢查 真菌血培養按《侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南》進行。

1.5G試驗和GM試驗陽性判斷的標準 G試驗結果以試劑盒說明書中1，3-β-D-葡聚糖≤60 pg/mL為陰性。 GM試驗結果以試劑盒說明書中血清指數I>0.5為陽性；I≤0.5為陰性。

2 結 果

2.1IFD組、非IFD組的G試驗和GM試驗檢測值水平 以血培養真菌結果為IFD確診指標，將病例分為IFD組和非IFD組，G試驗和GM試驗的檢測值水平見表1。

表1 IFD組和非IFD組G試驗和GM試驗 檢測值水平

2.2G試驗和GM試驗診斷IFD的臨床效能 以G試驗和GM試驗檢測結果大于陽性判斷值為IFD實驗室指標，以血培養真菌陽性結果為IFD確診指標。G試驗、GM試驗診斷IFD的靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、約登指數性能指標，見表2。

表2 G試驗、GM試驗診斷IFD的性能效能(%)

注：*串聯檢測表示，兩項試驗均為陽性；并聯檢測表示，兩項試驗中任何一項試驗陽性;a：與G試驗比較差異有統計學意義，P<0.05；b：與GM試驗差異有統計學意義,P<0.05；c:串聯與并聯試驗差異有統計學意義

2.3不同濃度水平的G試驗和GM試驗對IFD診斷效能 將G試驗在不同濃度水平下診斷IFD的效能作ROC曲線分析，G試驗濃度在43.5 pg/mL時，靈敏度75.5%，特異度92.4%,診斷效能最高，SROC=0.859(95%置信區間78.9%～93.0%)。見圖1。

圖1 G試驗診斷IFD的ROC曲線

將GM試驗不同血清學指數用于診斷IFD作ROC曲線分析，GM試驗血清學指數在0.49時，靈敏度和特異度分別為40.8%和93.6%,診斷效能最高，SROC=0.581(95%置信區間47.2%～68.9%)。見圖2。

圖2 GM試驗診斷IFD的ROC曲線

圖3 侵襲性真菌感染的菌株分布

2.4侵襲性真菌感染的菌株類別分布 血培養真菌陽性的49例IFD確診病例中，經鑒定為熱帶念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、擬平滑念珠菌、隱球菌等，各類菌株分布見圖3。

3 討 論

本文表1顯示，IFD組和非IFD組的G試驗和GM試驗檢測結果差異有統計學意義(P<0.001)，G試驗和GM試驗結果的合理應用將為臨床IFD的早期診治提供重要依據。從本研究結果表2中顯示，G試驗和GM試驗診斷IFD特異度均大于90.0%，串聯檢測(兩項中任一項陰性)特異度可達99.0%，比單獨使用G試驗和GM試驗診斷IFD有顯著統計學意義(P<0.05)，說明G試驗和GM試驗陰性結果時可擬排除真菌感染，聯合檢測診斷效率更高。G試驗單獨用于IFD診斷的靈敏度為65.3%，與文獻報道[9-13]的靈敏度偏低,這是否與其他研究未全部使用無菌體液真菌病原學來確診IFD有關，這還需進一步探討。如G試驗和GM試驗并聯使用(兩項中任一項陽性)可提高IFD診斷靈敏度至71.4%，而GM試驗單獨用于IFD診斷的靈敏度較低只有24.5%，這可能與GM試驗主要用于侵襲性隱球菌、曲霉菌和青霉菌等感染有關[14 ]，本文血培養確診為隱球菌的只有2例，表明GM試驗單獨作為血流侵襲性真菌感染的實驗室指標效率較低。G試驗和GM試驗臨床診斷界值的合理設置有助于提高診斷效能，經ROC曲線分析，G試驗檢測濃度在43.5 pg/mL時，診斷效能最高，靈敏度75.5%，特異度92.4%,SROC=0.859(95%置信區間78.9%～93.0%)；GM試驗血清學指數為0.49時，診斷效能最高，靈敏度和特異度分別為40.8%和93.6%,SROC=0.581(95.0%置信區間47.2%～68.9%)。

從本文確診的49例IFD血培養真菌陽性菌株分析(圖3)，侵襲性真菌感染的菌株主要為熱帶念珠菌17例(34.7%)，白色念珠菌13例(26.5%)，近平滑念珠菌10例(20.4%)，光滑念珠菌5例(10.2%)，擬平滑念珠菌、隱球菌及其他共4例(2.0%、6.1%)，相關信息可為臨床治療提供參考。

G試驗和GM試驗臨床應用時應注意假陽性和假陰性干擾，本文最后確認的41例G試驗或GM試驗假陽性中，有6例經血液透析；34例使用了頭孢、碳青霉烯類藥物或輸注了血液制品，1例為銅綠假單胞菌血流感染。確認的24例G試驗或GM試驗假陰性中，有1例為隱球菌感染，17例使用了抗真菌藥物，3例為近平滑念珠菌感染，剩余3例原因不明。此外IFD患者容易合并其他細菌感染，本研究中有14例合并血流細菌感染。國外文獻[15]認為血流細菌感染組與無血流細菌感染組的G試驗結果差異有統計學意義，而國內研究認為差異無統計學意義[16]。本文合并感染的病例中只有1例假陰性，因此，真菌合并細菌感染時，G試驗與GM試驗對侵襲性真菌病診斷效能是否有影響也值得進一步研究。

用血培養真菌結果作為IFD診斷的“金標準”研究G試驗和GM試驗的臨床應用價值，降低了以臨床診斷的不確定性帶來的偏差，為G試驗和GM試驗的臨床應用研究積累了更客觀數據。但研究時應注意不確定血培養結果的負面干擾，本研究明確為干擾血培養真菌假陽性病例就有17例。排除干擾外還應注意局部深部組織器官真菌感染時，血培養可出現非陽性結果。正如在本研究收集資料時發現有7例通過病理組織檢查確診侵襲性肺真菌病，但多次血培養均為陰性，其中G試驗和GM試驗診斷IFD靈敏度分別為42.9%和57.1%，并聯檢測靈敏度為71.4%。可以看出G試驗靈敏度較上述研究中[1-7]較低，可能與這7例中有3例為肺部隱球菌感染以及病檢病例數量不足有關。因此G試驗和GM試驗對于局限深部真菌感染的診斷仍然有不確定性，僅僅依靠臨床診斷不足以確定其真實診斷效能，還需要更多的病檢結果或其他金標準來支撐,但因為本研究聚焦于血培養作為金標準故未將此類病例納入。此外，本研究只將無菌體液聚焦到了血液，而胸腹水、腦脊液等其他無菌體液標本未納入研究，以及血液真菌培養陽性率不理想等影響了確診數據收集的量和完整性，今后研究應增加其他無菌體液標本真菌培養結果，以及病理診斷結果，為G試驗和GM試驗診斷IFD積累更多客觀證據。

4 結 論

以血培養真菌結果作為IFD診斷的“金標準”來研究G試驗與GM試驗的臨床應用價值，減少了因臨床診斷IFD帶來的不確定性。研究表明：G試驗與GM試驗是IFD早期診斷的重要實驗室指標，聯合檢測可提高診斷IFD靈敏度和特異度；特別是陰性結果對排除侵襲性真菌病的意義更為重大，同時設置合適的臨界值可以較好地提高診斷準確性。綜上所述，對其合理應用、綜合分析可有效提高IFD的診治水平，推進早期診斷、早期治療，減少誤診及漏診。