電感耦合等離子體質譜儀在血流感染早期診斷中的初步應用

趙蘇瑛,蔣 維△,吳 倩

(1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京 210029；2.南京醫科大學公共衛生學院，江蘇南京 210029)

目前將敗血癥和菌血癥統稱為血流感染，血流感染是一種嚴重的全身性感染綜合征。近年來，隨著創傷性診療技術的廣泛開展以及廣譜抗菌藥物、激素和免疫抑制劑的廣泛使用，血流感染的發病率有逐年增高的趨勢。據報道，全球每年大約發生200 000例血流感染，病死率在25%～60%[1-2]。血流感染的常見菌有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及凝固酶陰性的葡萄球菌等。由于傳統的培養耗時長，細菌的耐藥性變化大且與細菌本身的毒力和侵入的途徑和數量均相關，發生血流感染的患者很難在早期獲得有效地治療，而早期診斷早期用藥對降低血流感染病死率，改善預后至關重要。當前，傳統的血培養仍然是診斷血流感染的金標準，但是它耗時長，敏感度低并且對于采集時間有嚴格的要求，更重要的一點是血培養對于某些細菌是無效的。因此，亟需一種高效快速且能早期診斷血流感染的方法。

在醫學微生物的鑒定領域，質譜法近年來得到飛速發展，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)現在已經廣泛應用于臨床微生物的鑒定，但是對于血流感染，必須先獲得純培養才能進一步鑒定，相對于傳統方法來說，節省的時間很有限，而電感耦后等離子體質譜儀(ICP-MS)可以直接測定血液樣本中的金屬離子含量不需經過傳統的培養步驟，因此在血流感染的早期診斷方面擁有廣闊的應用 前景。

1 材料與方法

1.1研究對象 本實驗一共收集了58例血流感染患者的血液標本，將血液經增菌培養后獲得純培養菌落。其中14例患者為葡萄球菌感染，包括金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌等，患者平均(65.57±15.82)歲，男11例，女3例；39例為腸桿菌科細菌感染，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等；平均(68.64±10.33)歲,男20例，女19例；5例感染腸球菌，主要為屎腸球菌和糞腸球菌，平均(71.00±14.16)歲，男2例，女3例；陰性對照組58例，平均(63.30±8.88)歲,男38例，女15例。

1.2試驗材料 5種HPLC級混標液購自上海凱萊生物，定標液購自中國國家有色金屬及電子材料分析測試中心，實驗用超純水由美國Milli-Q超純水儀制造，所有的試劑和化學用品均采用分析級。

1.3樣品制備 經知情同意后，抽取血流感染患者組和健康對照組5 mL外周血，3 500 r/min離心10 min分離血清，置于-20 ℃保存。使用前在室溫下融解并振蕩混勻5 min，然后在200 μL血清內加入600 μL濃硝酸和50 μL內標液。混合溶液在85℃孵育2.5 h后加入去離子水至5 mL，置于4 ℃待檢。

使用注射器吸取0.5 μL血流感染患者的全血注入10 mL增菌液中37 ℃孵育過夜，然后取1 mL菌液轉至新鮮培養基中，調整OD值使之介于0.3～0.6之間，取2 mL培養基12 000× g離心5 min，收集上清液，重復上述操作[3]。

1.4金屬元素分析 本試驗均采用PICAP Q ICP質譜儀(美國，Thermo公司)，一共測定68種金屬元素。

1.5數據分析

1.5.1試驗數據處理 ICP-MS工作站導出的半定量結果用二維數據矩陣表示，金屬元素分布圖用GraphPad prism 6軟件繪制。

1.5.2金屬元素的挑選 為了尋找兩組之間的差異，本文使用SIMCA軟件包(SIMCAP 13.0)對數據進行多維和一維統計分析。所有的數據在經過簡單歸一化后輸入到軟件中，然后進行主成分分析(PCA)，找出觀察組之間金屬元素最主要的趨勢。之后再用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分析組間變異性以期更好地揭示群體結構，在PLS-DA中VI1被認為組間差異具有統計學意義，本文將VI1的數據進一步行t檢驗[4-5]。此外q檢驗被用來降低假陽性率和過擬合。那些同時符合VI1且P<0.05的金屬元素被認為具有統計學意義，可作為潛在的標志物[6]。

1.5.3統計學處理 使用OriginPro 9進行相關性分析，分析方法選用Pearson檢驗，并繪制擬合曲線。

2 結 果

2.1血流感染時金屬元素分布情況 發生血流感染時金屬元素的分布如圖1所示。PLS-DA的模型圖如圖2所示，PLS-DA的基本參數如表1所示，R2Y(累積的因變量指數) 和Q2Y(交叉驗證的有效性指數)均大于0.7，表明該模型穩定、可靠，見表1。

2.2潛在標志物的選擇 根據VIP值和P值確定潛在金屬標記物，先用VI1初步篩選，再用方差分析進一步驗證，P<0.05被認為差異具有統計學意義。挑選出的潛在金屬標記物如表2所示。為了在其中挑選出有意義的金屬元素，本文進一步使用Pearson相關分析來評估那些濃度水平明顯不同的元素，如表3所示，鈀、金、釷和錫在四種類型的血流感染中均出現了濃度的變化，在3種類型的血流感染中出現濃度變化的有鋰、銻和鋅，而另外的一些元素，如鍶、鈣、鈮和硒等則在其中兩個類型的血流感染中出現明顯的濃度變化，還有一些則在某一特定類型血流感染中出現濃度變化。如表4所示，鈣與金黃色葡萄球菌血流感染呈負相關性，鈀和金與大腸埃希菌的血流感染呈正相關性。

表1 PLS-DA 參數

注：A為血流感染患者血清金屬元素分布;B為金黃色葡萄球菌血流感染患者血清金屬元素分布;C為大腸埃希菌血流感染患者血清金屬元素分布;D為腸球菌血流感染患者血清金屬元素分布;E為肺炎克雷伯菌血流感染病人血清金屬元素分布

圖1血流感染患者血清中金屬元素分布圖

表2 血流感染患者血清中的DME

續表2 血流感染患者血清中的DME

注：A為血流感染組；B為金黃色葡萄球菌血流感染組；C為大腸埃希菌血流感染組；D為屎腸球菌血流感染組；E為肺炎克雷伯菌血流感染組

圖2血流感染時金屬元素的PLS-DA模型

表3 不同感染類型濃度明顯改變的元素一覽表

表4 金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌血流感染中 DME的相關性分析

3 討 論

本研究中筆者共測量了58份標本，68種金屬元素，獲得了血流感染患者體內的金屬元素分布圖譜，這不僅有助于區分健康個體與血流感染患者，而且對研究該疾病的發病途徑也具有重要意義。依托ICP-MS的先進技術，使得在數小時內獲得可靠結果成為可能，毫無疑問，這將給臨床提供一個微生物感染診斷的新平臺[7]。

很多細菌感染都伴隨著體內微量金屬離子濃度的異常改變。隨著現代醫學的發展，越來越多的學者開始關注金屬元素與疾病之間的關系。

生物體內元素的變化與體內環境和代謝有關。在體內環境保持不變的情況下，一些疾病引發的金屬代謝障礙會導致體內元素紊亂，但是具體機制很復雜，目前仍在研究中。與對照組相比，發生血流感染的患者血清中金屬元素有一些發生了明顯的變化，本文認為這些變化與感染及發生感染的種類有關。一方面，由于體內金屬元素水平的不穩定，一些炎癥因子的活性和含量受到影響，從而影響細胞免疫水平，進一步影響血流感染的發生和進展。

在發生感染時本文檢測到鉑、金、釷和錫的濃度均有改變，除個別患者因為機體的排泄功能異常導致的元素濃度異常外，本文認為這與這些金屬的功能有關。如本試驗中鈀和金在大腸埃希菌血流感染者血清中的濃度與細菌中濃度呈正相關性。已有研究發現大腸埃希菌的產物可以在溶液中結合鈀離子[8]。大腸埃希菌至少能產生Hyd-1、Hyd-2和Hyd-3 3種水解酶[9]；Hyd-1和Hyd-2是膜結合的呼吸同工酶，它們的催化亞單位暴露于膜的胞質側，Hyd-3是甲酸脫氫酶復合體的一部分，這3種氫化酶都有助于鈀離子還原[10]。因此血液中鈀離子的濃度升高也會使大腸埃希菌的體內鈀離子濃度升高，兩者表現一致。另外有研究表明金在特定載體上分散成超微粒子后，對很多物質的氧化具有優異的催化性能[11]，細菌能夠迅速還原金離子并將其還原成元素金[12]，生物體內的氧化反應眾多，因此血清內金離子濃度升高會導致細菌吸附的金離子越多，細菌體內金元素的含量也就越高。

在血流感染中濃度明顯改變的金屬元素還有鋰、鐵、鋅、鈣等。有報道稱鋰在一些炎性反應中能促進抑炎因子的分泌同時抑制促炎因子的分泌[13]，因此血流感染時會出現血清鋰濃度的變化。

金屬離子(Cu2+、Zn2+、Sn2+)具有廣譜而強大的抑菌作用，根據實驗研究，金屬離子系列抑菌性物質對大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌等均有殺滅抑制能力。體內鐵元素缺乏會導致IL-4和IL-6活性降低，此外，鐵依賴性酶和含鐵的酶類合成也會受阻，同時CD4和CD8活性的改變，導致CD4/CD8比值下降，機體免疫功能下降[14-15]。鋅在體內也參與多種酶的合成[16]，鋅元素缺乏會降低這些酶的活性，導致巨噬細胞和體細胞功能紊亂，皮質區T淋巴細胞減少，胸腺萎縮，最終出現體液免疫和細胞免疫功能紊亂，造成免疫缺陷。研究證實，銫對機體的細胞免疫、體液免疫及器官的非特異性免疫有顯著影響，銫濃度的降低會抑制免疫球蛋白和抗體的產生，降低抗體滴度，削弱免疫功能，還會造成中性粒細胞趨化作用損傷和吞噬細胞功能低下[17]。本文推測金屬代謝的異常誘發了代謝性疾病和免疫力低下，從而導致了血流感染的發生。

血流感染總是伴隨著炎癥，炎癥細胞浸潤和組織壞死。某些金屬元素的濃度變化可能與炎癥有關[18]。在本次試驗中，本文發現的大量與血流感染相關的金屬元素并不屬于體內常見的微量元素，這表明與細菌導致的血流感染相關的元素可能并不僅僅局限于常見的微量元素。

發生感染時，游離在血液中的金屬元素與細菌本身的金屬元素之間的模式比較目前并無報道，本文在試驗中對兩者進行比較后發現，鈣在金黃色葡萄球菌血流感染者的血清中與在細菌中的濃度呈負相關。金黃色葡萄球菌的毒性與生物膜相關蛋白的結構和模式有關[19]，而鈣離子以一種濃度依賴性的方式調節金黃色葡萄球菌生物膜的結構[20]，歸根到底，金黃色葡萄球菌的毒性與這些蛋白中的鈣離子濃度相關。鈣離子作為一種生物多樣性必需的堿性金屬離子，高濃度時可以破壞金黃色葡萄球菌的生物膜結構，殺傷靜止期金黃色葡萄球菌，同時可消除病原菌的耐藥性[21]。

鈀除了與大腸埃希菌血流感染呈正相關性外，在腸球菌血流感染中濃度也與細菌體內濃度呈正相關性，而鈹在血清中的濃度與細菌體內呈負相關性。有數據表明鈹會破壞細胞膜成分和結構，影響細菌合成細胞外多糖，導致細菌間聚集力增加，對細菌存在抑制作用[22]。因此發生細菌感染時，鈹的濃度降低是可以解釋的。

4 結 論

本研究提出了一種基于ICP-MS技術的金屬組學方法以期應用于血流感染的早期診斷，本研究建立了細菌血流感染時的金屬元素分布圖和不同類型細菌感染時的特異性金屬分布圖，并初步篩選出了潛在的DME。此外還測定了金屬元素與感染的相關性，發現了一些特異性的可以進一步深入研究和驗證的金屬元素。金屬組學有望成為一種簡單快速的用于臨床篩檢早期血流感染的有效手段。