化學發光法檢測肺炎衣原體抗體的性能評估

周 湧，李慧敏，李夏萌

(東莞市第五人民醫院檢驗科，廣東東莞 454002)

肺炎衣原體(CP)是社區獲得性肺炎(CAP)中非常重要的非典型病原體之一[1]。研究表明,CP可能誘發CAP患者的慢性咳嗽(CC)。CC是復發性和難治性呼吸系統疾病之一，導致CAP的延遲治愈。雖然，CAP通常不會產生嚴重的臨床結局，但是如果遷延不愈也可以引起多種器官的并發癥，影響患者的生理和心理健康[2]。另外，CAP通常也合并有其他的細菌感染[3]。因此，發明快速而準確的實驗室檢測方法對于CP感染的早期診斷和早期治療非常關鍵。目前，對于CP的實驗室檢測方法包括病原體分離培養法、直接檢測法、熒光定量核酸擴增法(FQ-PCR)以及血清檢測法。血清檢測法又包括化學發光法(CLIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)以及間接免疫熒光(IIF)等。ELISA實驗步驟多，干擾環節多；IIF只能檢測IgM，而目前對于CLIA在CP抗體檢測中的作用卻缺乏研究。本研究擬探討化學發光法(CLIA)檢測肺炎衣原體IgG和IgM抗體的性能，并且與ELISA和IIF相比較，以期為臨床上采用這種方法早期診斷CP造成的CAP提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年12月在本院呼吸內科接受治療的200例CP患者作為觀察組，男115例，女85例，年齡4～80歲，平均(31.2±4.5)歲。納入標準：(1)成人CAP感染符合中華醫學會呼吸病學分會制定的《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》的相關診斷標準[4]。(2)兒童CAP感染符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童社區獲得性肺炎管理指南(2013修訂)》中的相關診斷標準[5]；(3)臨床上出現不同程度的發熱、咳嗽、咳痰癥狀，可伴有呼吸困難、惡性嘔吐等癥狀。(4)結合患者的血常規、肺部X線片、痰培養、血培養等相關輔助檢查結果，確定診斷為社區獲得性肺炎。(5)兒童CAP感染患兒年齡在12歲以下；(6)急性期患者，病程<3 d。(7)病情嚴重程度均為輕中度。(8)無嚴重心、肺、肝、腎功能不全。(9)患者知情同意，自愿參加本項研究。排除標準：(1)合并其他病原體的肺部感染；(2)合并其他感染性疾病，如結核感染，或有結核病史等；(3)嚴重心、肺、肝、腎功能不全。(4)無法排除醫院感染可能性的患者；(5)伴有免疫系統異常疾病的患者；(6)患者及家屬不配合治療，依從性差者。選擇同期在本院體檢中心接受體檢的200例健康受試者作為對照組，男112例，女88例，年齡5～78歲，平均(30.50±5.3)歲。兩組受試者的性別和年齡差異均無統計學意義。分離靜脈血血清，于-20 ℃冰箱保存，第1次復溶后于2～8 ℃冰箱保存，24 h內完成試驗。

1.2檢測試劑 CPIgG和PCIgM抗體試劑(試劑批號分別為20171205和20171207，亞輝龍生物科技股份有限公司，中國)； CPIgG和CPIgM抗體ELISA試劑盒(試劑批號分別為ZK-H2323和ZK-H2325，美國R&D公司)； CP間接免疫熒光抗體(試劑批號RD455645，美國R&D公司)。

1.3檢測設備 iFlash 3000化學發光免疫分析儀(型號：FA6C-00000A64，亞輝龍生物科技股份有限公司，中國)，Biotek酶標儀(型號：CYT50-0000065，Molecular Devices，美國),Mikon E3600熒光顯微鏡。

1.4性能評估方法 參考美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)[6]制訂的《體外診斷試劑性能分析指導原則》，檢測CPIgG和CPIgM的性能檢驗指標包括：最低檢出限( LoD)、批內精密度、批間精密度、線性范圍以及臨床符合率。

1.4.1最低檢出限 參考CLSI的EP17-A2文件[7]進行驗證，以評價該方法的。選擇低濃度梯度樣本5份，重復測試20次，設定Ⅱ類錯誤水平β錯5%，若數據呈正態分布，則采用參數方法估計LoD，若呈非正態分布，則采用非參數方法估計LoD。

1.4.2精密度 精密度為評價測量中隨機誤差程度的指標。表達方式采用變異系數(CV)，CV越小，精密度越好。參考CLSI的EP5-A文件[8]進行驗證。批內精密度選擇CPIgG和IgM各高低2個濃度水平的樣本，1 d內重復檢測20次；批間精密度選擇CP-IgG和-IgM各高低2個濃度水平的樣本，每個水平每天重復檢測4次，共檢測5 d。

1.4.3線性評價 參考CLSI的EP6-A文件[6]進行驗證，采用已知濃度為3.0、30.0、40.0、50.0、60.0、100.0、200.0 AU/mL的系列標準溶液，分別由測試產品測量。應用線性回歸，使用已知濃度繪制數據X軸上的樣本和Y軸上的測量平均值，兩軸均以10為底的對數繪制坐標。測試產品的線性范圍。

1.4.4臨床符合率 參考CNAS-CL39文件[9]進行驗證，選擇確診CP的陰性和陽性標本各200例，使用CLIA檢測標本的CPIgG和CPIgM抗體。

1.5統計學處理 統計分析使用SPSS19.0軟件進行。線性范圍通過線性回歸分析計算。不同方法學之間的一致性程度通過Kappa檢驗評估，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1最低檢出限 測試產品用于測量稀釋的梯度L-系列標準品的濃度并產生標準劑量-反應曲線(圖1)。同時，0 AU/mL標準溶液(空白參考)的樣本在檢測中獨立檢測20次。最低檢測濃度的平均值為0.009 2 AU/mL，低于0.01 AU/mL。因此，CLIA的LoD為0.01 AU/mL。

圖1 CLIA法的標準劑量-反應曲線

2.2精密度 如表1、2所示，CLIA具有2.15%～6.47%的批內CV和3.17%～6.18%的批間CV，表明CLSI的結果具有良好的重復性。

表1 CLIA檢測CP-IgG抗體的精密度

表2 CLIA檢測CP-IgM抗體的精密度

2.3線性評價 當CPIgG抗體在3.0～200.0 AU/mL時，擬合曲線為Y=0.937 4X-5.327，R2=0.993 4，驗證通過。見表3。

表3 CLIA法檢測CPIgG抗體的線性 評價實驗結果(AU/mL)

2.5方法學之間的一致性

2.5.1采用CLIA和ELISA分別檢測200例樣本的CPIgG和CPIgM抗體，通過Kappa檢驗評估，Kappa分別=0.900和0.903(均P<0.001)。一致百分比分別為85.0%和85.5%，見表4、5。

表4 CLIA與ELISA檢測CP-IgG抗體的結果比較(n)

表5 CLIA與ELISA檢測CP-IgM抗體的結果比較(n)

2.5.2采用CLIA與IIF以不區分抗體類型檢測200例樣本的CP抗體，通過Kappa檢驗評估，Kappa=0.905(P<0.001)。一致百分比為80.0%，見表6。

表6 CLIA與IIF檢測CP抗體的結果比較(n)

3 討 論

CP于1986年首次發現，到1989年，CP被確認為沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體之后的第三種衣原體。 CP分布在世界各地，并通過氣溶膠在人群中傳播[10-11]。CP原發性感染3周后，即可檢測到IgM抗體。在急性或既往感染患者的血清中可以檢測到抗體。臨床一般在第2周，第3周和第6周進行進一步的測試，以區分新感染與既往感染或慢性感染。因此，CP感染后抗體的形成慢于其他病原體[12]。CPIgG抗體水平通常在再感染后1～2周升高，但有時候沒有再感染也會升高。CPIgM抗體水平在再感染時可能會稍微升高。

大約一半的CP感染患者無癥狀或僅有輕度咽痛。其他CP感染癥狀包括：持續性干咳、頭痛和發熱。CP慢性感染在成人中更常見。超過50%成人感染過CP，產生CP抗體。CP感染可誘導特異性T細胞免疫和B細胞免疫。抗體可能會暫時提供一定的免疫保護，但是其免疫力不夠強，只能保持短暫時間，這在大多數情況下不能阻止再次感染反復發作。血清流行病學研究有表明CP感染3～5年后血清抗體會減少或消失[13]。CP特異度IgM和IgG抗體可以在健康者身上檢測到，這表明存在健康的攜帶者。CP是一種常見的人類呼吸系統感染性疾病病原體。近年來，CP被發現與一些相關慢性疾病，包括支氣管哮喘、冠心病疾病和動脈粥樣硬化，以及一些比較罕見的疾病，如腦膜炎、心肌炎和格林巴利綜合征有關。最近的臨床研究也發現，CP抗體檢測結果較高的患者更有可能存在多種全身性疾病，包括咽炎、喉炎、鼻炎、鼻竇炎、結節病、惡性淋巴瘤、多發性硬化癥、老年癡呆癥、肺癌、早產和胎膜早破[3-4,13]。CP已成為一種嚴重危害人類的病原體，因此引起越來越多的學者的關注。

《醫學實驗室質量和能力認可準則》中規定，對開展某一新的檢測項目，更換檢測系統或儀器或改變檢測試劑盒生產商時，實驗室需要對其相關方法學分析性能予以驗證，對廠商提供的評價資料中的主要性能予以確認。因此，本研究根據由CLSI制訂的《體外診斷試劑性能分析指導原則》，在檢測CPIgG和CPIgM的性能檢驗指標選擇最低檢出限、批內精密度、批間精密度、線性范圍以及臨床符合率。CLSI檢測CPIgG的最低檢測限為0.01 AU/mL，臨床應用可接受。CLSI檢測CPIgG與CPIgM的批內、批間精密度較小，表明CLSI檢測CP分型抗體的結果具有良好的重復性。CLIA檢測CPIgG抗體在3.0～200.0 AU/mL線性范圍內，擬合曲線符合R2≥0.990，0.85

根據一致性強度的判定標準：Kappa值為正數，而且Kappa值越大，一致性越好。Kappa≥0.75，表明一致性良好；0.40≤Kappa<0.75，表明一致性一般；Kappa<0.40，表明一致性較差[14]。本研究結果顯示，CLIA和ELISA檢測CPIgG和CPIgM抗體的Kappa分別為0.900和0.903。一致百分比分別為85.0%和85.5%，表明CLIA和ELISA檢測CPIgG和CPIgM抗體的一致性較好。另外，CLIA與ELISA檢測CPIgG及CPIgM抗體陽性率結果存在差異，其原因可能主要來源于不同季節、不同人群以及患者處在不同的感染階段，均可導致陽性率的差異。此外，CLIA和IIF檢測CP抗體的Kappa為0.905(P<0.001)。一致百分比為80.0%，表明CLIA和ELISA檢測CP抗體也具有較好的一致性。

自發明以來，CLIA已廣泛應用于臨床診斷和環境分析[15]。在最初階段，CLIA通常使用化學發光指示劑[16]，如異魯米諾，吖啶酯等，直接標記抗原(抗體)。盡管CLIA技術提高了免疫分析的靈敏度，化學發光的直接標記指標受到相對較短的發光持續時間的限制，所以它的應用需要機器來協助。因此，近年來發明了基于化學發光的酶-抗體綴合物底物和發光計用于測量抗體的水平，具有較高的靈敏度和更大的檢測線性范圍[17-23]。

4 結 論

CLIA檢測CP抗體的各項指標符合生產廠家的聲明和臨床要求。CLIA法具有操作簡便、靈敏度高、特異度強、精密度高、檢測范圍寬等優點，臨床上可以替代ELISA和IIF用于CP抗體的檢測。