HPV檢測方法及微流控芯片技術的應用

周笑伶,曹 勤 綜述,王生余△ 審校

(1.江蘇省第二中醫院檢驗科，江蘇南京 210017；2.南京中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，江蘇南京 210017)

宮頸癌發病率位居全球女性惡性腫瘤第二位，每年因宮頸癌死亡人數達27萬人，占女性腫瘤病死率的首位(其中80%發生在發展中國家)，并以每年50萬新增病例的速度增長[1]。研究發現，99.7%的宮頸癌患者存在人乳頭瘤病毒(HPV)感染[2]，且HPV的持續感染是導致宮頸癌前病變和浸潤癌的必要因素[3]。

HPV是一種長度為50～55 nm，無包膜的小分子雙鏈DNA病毒，HPV僅編碼八個基因，包含支持病毒DNA復制的6個早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和編碼病毒組裝與釋放所必需衣殼蛋白的2個晚期基因(L1、L2)。病毒編碼的癌基因不會導致宿主細胞的直接轉化，但會誘導免疫逃逸和異常細胞增殖使基因組結構畸變和突變[4]。按照潛在致癌性，通常將HPV病毒分為低危型和高危型，高危型HPV的持續感染可引起宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌[5]。事實上，90%的宮頸癌可以通過早期檢查得以治愈，美國因及時篩查出早期癌前病變并治療，使得宮頸癌發病率和病死率下降了60%[6]，而發展中國家缺乏定期的健康檢查和正規的醫療保健體系，往往錯過了宮頸癌的早期診斷，病死率是美國的50倍[5]。因此，亟待推行一個快速、低成本的人口水平篩查和監測的方法，來降低宮頸癌的發病率，提高人民健康水平。

巴氏染色宮頸細胞學涂片檢查是已知最早的宮頸癌篩查標準，自20世紀50年代引入臨床，使55歲以下宮頸癌病死率下降60%[7]。到了90年代，薄層液基細胞學檢查(TCT)取代了巴氏涂片檢查，使高分化鱗癌檢測靈敏度提高1.29倍，但對于細胞學結果的解釋不僅與相關人員的經驗和水平相關，而且對于血液模糊、炎癥干擾、固定不良、細胞溶解或細胞不足(<5 000個可見的液基細胞)的樣本，或是有爭議的細胞涂片，如非典型的意義不明確的非典型鱗狀細胞、不能排除高度鱗狀上皮內病變的非典型鱗狀細胞和非典型腺體細胞，則需要進行分子學檢測以得到更明確的診斷[8]。HPV檢測被FDA(美國食品藥品監督管理局)批準用于對宮頸細胞學檢查結果異常的患者進行后續檢測，以避免不必要的陰道鏡檢查。

1 人乳頭瘤病毒主要檢測方法

1.1第二代雜交捕獲法(HC2)檢測HPV-DNA HC2檢測法由Digene公司開發，并于1999年被FDA批準，其實質是分子雜交信號放大技術。該檢測方法采用能檢測出13種高危型HPV的多基因RNA探針，捕獲結合后的雜合體至包被有單克隆抗體的板孔上，最后借助信號放大和化學發光技術完成基因水平檢測。

臨床研究表明，HC2檢測法可指示高危型HPV-DNA的存在，且對高度組織病變具有高靈敏度，比宮頸細胞學檢查更易發現高度病變人群[9]。但是，該方法無法區分特定的HPV基因型，不包含內部對照，且探針使用時，存在堿基對錯配、探針混合物與非靶向的高危和低危的HPV6、11、26、30、40、42、53、54、61、67、70、73、81、83、84、87和91交叉反應等問題[10]。

1.2酶切信號擴大法(Cervista HPV-HR)檢測HPV-DNA Cervista HPV-HR檢測法由Third Wave Technologies公司開發，并于2009年被FDA批準。基于專利Invader信號放大化學發光技術，該方法在等溫反應環境下，借助Cleavase酶特異識別、切割目標DNA分子結構，并利用能檢測出L1，E6和E7基因序列的特異探針完成對14種高危型HPV-DNA的識別、檢測。與HC2檢測相比，該方法具有樣本量少，包含內、外部對照，交叉反應較低等優點，但仍不能進行單個基因分型[10]。

1.3實時熒光定量PCR技術(Cobas 4800)檢測HPV-DNA Cobas 4800 HPV檢測法由Roche Molecular Diagnostics公司開發，并于2011年被FDA批準。該檢測采用多重實時PCR和與4種熒光報告探針進行的核酸雜交技術，完成對14種高危型HPV的L1基因的核苷酸序列的同時檢測。實驗使用β-珠蛋白作為提取和擴增的內部對照，外部設有陰、陽性對照來保證運行質量。該系統由兩個獨立的儀器組成，包括用于自動化核酸提取的Cobas z480儀器和用于在單個管中進行PCR擴增和檢測反應的Cobas x480分析儀。可以檢測14種高危型HPV并對HPV16和HPV18進行單獨的基因分型。與HC2法相比，Cobas 4800試驗具有與HC2相當的臨床敏感性，并且由于與低風險HPV基因型的交叉反應水平較低[11]，特異度提高。但也可能出現假陰性結果，因為L1基因在大量癌癥中整合到人類基因組中時會丟失，在這種情況下，僅檢測L1基因的HPV測試系統就可能出現假陰性結果[12]。

1.4逆轉錄擴增法(Aptima HPV)檢測E6/E7 mRNA Aptima HPV檢測法由Hologic Gen-Probe公司開發，并于2012年被FDA批準。該方法通過檢測高危型HPV E6/E7癌基因mRNA間接測定HPV-DNA含量。研究表明，病毒癌基因E6和E7能促進被感染細胞中的腫瘤抑制基因p53降解，并改變調節細胞周期的蛋白質的活性，導致細胞轉化。此外，盡管E6和E7基因表達量少，但其過表達可能與疾病進展直接相關。Aptima HPV檢測法可檢測14種高危HPV類型的E6/E7 mRNA轉錄物，而且不與低危型HPV(HPV6、11、42、43、44、53、61、71和81)產生交叉反應，具有相當高的分析靈敏度，但仍不區分HPV類型[13]。

此外，上述方法需要高度專業化和體積龐大的儀器用于樣品預處理和后續檢測，例如Cobas HPV系統重量超過150 kg，寬度為166 cm，而Cervista HPV HR檢測系統重量約363 kg，高度超過175 cm，并且PCR擴增過程中對實驗設備要求也特別嚴格，通常要求檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室的設置要求并通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證，同時檢測人員須通過臨檢中心培訓并取得合格證書，操作環境保證無菌無塵。這些對于基礎設施比較差的發展中國家，尤其是一些偏遠的基層醫院是難以實現的，因此，能夠分離和檢測核酸生物標志物的簡單且有效的整合平臺仍然是醫學診斷中的重要需求。

1.5核酸篩選的最新發展——微流控芯片技術 近年來，隨著PCR擴增技術及微流控技術的發展，學者們開發了一個能集成樣品裝載、細胞溶解、擴增及檢測于一體的微流控芯片，并將該芯片成功地應用于HPV-DNA的檢測[14]。與上述幾種傳統的方法相比，該芯片具有靈活，體積小巧，便于移動，可自動操作等特點，可為不同的樣本提供標準化預處理單元，從而消除了因離心、混合和凍融步驟所導致的場地問題，甚至是PCR擴增的標準化問題。此外，該芯片還可以避免樣品多步處理過程中出現內源性核糖核酸酶激活、不適pH值和溫度，從而導致的樣品降解[15]。大量研究表明，這種能快速分離出病毒DNA，并在最小化人為干預的情況下，將其傳送到檢測裝置傳感器的封閉集成單元內的微流控系統是目前HPV檢測的最佳選擇。

一般來說，用于制作微流控芯片的材料主要包括：晶體硅、玻璃、石英、塑料和高分子聚合物等。其中，高分子聚合物(如聚甲基丙酸甲酯PMMA，聚苯乙烯PS等)由于具有加工方便、成本低、易批量生產等優點，被廣泛用于微流控芯片制造。微流控芯片制作的方法包括機械加工法、刻蝕法和模具法。其中，模具法由于具有低成本、快速成型、良好的光學性能和絕熱絕緣性能、易于封裝等特點，被廣泛使用于微流控芯片加工[16]。圖1A為Rheonix公司制作的用于HPV DNA檢測的微流控芯片，每個芯片由4個微流控通道陣列而成，可同時對4個樣本進行全自動化檢測。該芯片由1.0 mm厚的含有不連續通道的聚苯乙烯層和38 μm柔性聚苯乙烯層通過弱溶劑層壓法壓制而成。不連續通道間包含一組隔膜袋，并與安裝在其上的聚苯乙烯層結合，構成圖1B所示的泵/閥裝置。實驗中，對隔膜袋中的孔施加正壓，聚苯乙烯柔性層被向上推動，不連續通道斷開，完成閥門關閉，流體流動阻斷；對隔膜袋中的孔施加負壓，聚苯乙烯柔性層被拉入隔膜袋中，不連續通道連通，完成閥門開啟，流體在毛細作用下流動。依此規律，串聯的多個隔膜袋中的孔內壓力可依據設計的控制程序完成規律性變化，最終實現流體單/雙向流動控制，這為液體混合提供附加的通用性和有效性[17]。

A:微流控陣列;B:泵/閥裝置

圖1RheonixQuadCARD芯片外形

目前，基于微流控平臺，發展了許多用于生物分析的相關技術，如細胞分析[18]，核酸分析[19]，蛋白質工程[20]，突變檢測[21]，床旁檢測[22]等。KASAMA等[23]開發了基于聚苯乙烯微珠的微流體免疫吸附測定系統，用于分析人類免疫球蛋白A，使樣品體積縮小至微升范圍，抗原-抗體反應時間從15 h縮短至10 min。ZHANG等[24]集成了微流控和微珠陣列技術，開發了檢測血清提取物中HBV基因型的敏感片上病毒DNA分析方法。作者指出若使用TAMRA作為標記，試管法只能在0.1 nmol/L的靶DNA濃度下產生明顯的熒光信號，而芯片病毒基因分型可區分0.03 nmol/L的靶DNA；若使用量子點作為標記，芯片法甚至可檢測到4pM的靶DNA。與傳統的平面DNA芯片(通常>1 h)相比，微流控芯片提供了更高的分析靈敏度和更短的反應時間(<30 min)。

2 微流控芯片技術方法

微流控芯片法基本過程包括核酸提取、PCR擴增和反向斑點雜交。

2.1核酸提取 將待測樣本加入芯片加樣孔，在微泵驅動下，利用磁珠分離技術，即在通道內磁性、界面和黏性阻力的作用下，樣本與靶物質結合，從而快速高效地提取細胞DNA，同時很好地避免了人工提取過程中產生的污染和誤差。ZHANG等[25]開發了一種3D打印微流控芯片，并用實時q-PCR結果證明，其可以利用磁性運動，通過水油界面屏障來過濾樣本污染物并提純目的核酸，稱該芯片能在15 min內高效提取HPV18質粒，且提取效率達到61%(HPV質粒濃度為5×10至5×106copy/100 μL)，可以在大范圍HPV質粒濃度下實現較高萃取率。該過程保證了高純度的目的DNA檢測的準確度，是微流控芯片技術向著自動化和微型化發展的前提保障[26]。

2.2PCR擴增 針對HPV基因組設計特異度引物，對目的DNA進行PCR擴增，擴增出24種HPV基因型的目的片段，即可同時檢測出18種高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83)和6種低危型HPV(HPV6、11、42、43、44、81)。

2.3反向斑點雜交(RDB) 將針對HPV基因組設計的24種亞型的探針包被在芯片檢測區雜交膜上，若擴增產物中含有目的基因，則可被芯片上的探針捕獲，經酶和顯色液作用后可判斷出感染人乳頭瘤病毒核酸及感染的亞型。不同于傳統固定靶DNA一次只能檢測一種核酸型的雜交方式，包被探針再與目的DNA雜交的反向斑點雜交技術實現了同時檢測多種基因型的需要，使得檢測更加快速高效。與HC2相比，雖然兩種方法在HPV陽性檢出率上趨于一致，但RDB在反映檢測方法準確性的Yondon指數時更敏感[27]，而且檢測成本更加低廉。

3 微流控芯片技術在HPV-DNA檢測中的應用

微流控芯片系統實現了自動取樣、核酸純化、擴增和檢測于一體，且具有靈敏度高、檢測速度快、易于微型化、成本低廉等優點，已被開發用于HPV-DNA的檢測并得到了很好的結果。TASOGLU等[1]設計的微流控芯片，與傳統的核酸序列擴增相比，擴增至相同的熒光水平下，芯片法只需要1/2 000的樣本量。YUE等[18]構建了一種基于微流控和微珠陣列集成的多路復用生物分析敏感平臺，并采用該平臺平行檢測和區分了4種HPV基因型，同時鑒定了6種蛋白質標記物。研究結果表明該芯片可以檢測出25 pmol/L帶有特異度序列的目的DNA，在芯片外檢測中，需要靶DNA濃度達到360 pmol/L以至于信噪比(SNR)>3。此外，該平臺與傳統的流式細胞術相比，具有試劑消耗少、樣品注射簡單、標本污染少和靈敏度高等優點。ZHANG等[28]開發了一種基于微流體裝置和微珠陣列的檢測HPV基因型的方法。研究結果表明，該方法能分辨低至1 fmol/L (10 zmol/chip,SNR>3) 的HPV寡核苷酸DNA，且信號放大后使得芯片檢測靈敏度是芯片外的1 000倍。作者還指出該方法還可以對10 copy/μL 的HPV基因組DNA的PCR產物進行分辨和基因分型，檢測范圍從1 copy/μL至1×105copy/μL。

微流控系統的出現還為HPV細胞的收集和即時檢測提供了條件，BONK等[29]研究出了適用于微流控癌癥篩選裝置的模型，通過將與HPV感染相關的跨膜蛋白α6整合素的抗蛋白抗體涂覆于微通道表面，在微通道16～20 μL/min流速范圍內，正常細胞被洗脫而HPV感染細胞被保留，可收集這些病理細胞用于后續檢測。HWANG[30]在研究中指出，使用基于微流控技術發展起來的即時檢測(POCT)技術，檢測HPV16-DNA在樣本中的表達，結果與常規RQ-PCR方法一致(Kappa=1)，因為省略了分離和顯色步驟，使臨床樣本實現即時檢測成為可能。

4 小 結

微流控芯片技術在HPV檢測中主要有兩種用途：(1)用于宮頸細胞學檢查結果異常的患者。如存在非典型的意義不明確的非典型鱗狀細胞、不能排除高度鱗狀上皮內病變的非典型鱗狀細胞和非典型腺體細胞的患者篩查，需要進行分子學檢測以得到更明確的診斷，以確定是否需要進行陰道鏡檢查。(2)對易感女性進行病毒檢測及風險評估，為臨床醫生制定合理的治療方案提供依據。

微流控芯片技術的發展，為癌癥篩查、早期診斷、自我保健、疫苗接種和手術后監測提供了依據。因其在基因診斷方面的巨大潛力，此項技術也一定會更多應用到其他疾病相關分子水平的檢測中，如傳染病、腫瘤、對過敏原的免疫應答、免疫療法和化療等，成為更多疾病探尋致病機理和核酸分析的手段。