基于實時熒光環(huán)介導等溫擴增快速檢測雞肉中的大腸桿菌O157：H7

趙遠洋 王 瑾 林麗萍 郜彥彥 吳國平

（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室 南昌330045）

大腸桿菌（E.coli）O157：H7 是腸出血性大腸桿菌中最常見的血清型，也是其多種血清型中最主要的致病菌株，感染劑量低于5 CFU[1-2]。感染該菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎（hemorhabic colitis，HC），還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）及血栓性血小板減少紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等嚴重并發(fā)癥，致死率達5%～10%[3]。自1983年美國Riley 等[4]首次報道腸出血性大腸桿菌O157：H7以來，相繼在英國、加拿大、日本、德國等多國出現(xiàn)爆發(fā)性流行病例。我國自1986年江蘇徐州市首次報道大腸桿菌O157：H7 感染以來，廣西、海南、廣東等地都先后出現(xiàn)并分離到大腸桿菌O157：H7[5]。在世界范圍內(nèi)，家畜及其肉制品是大腸桿菌O157：H7 主要的傳播途徑，其中雞、牛、豬等是該菌主要感染對象[6]。如何快速檢測食品尤其是肉類食品中污染的大腸桿菌O157：H7，是有效防控大腸桿菌O157：H7 食源性疾病爆發(fā)的必要條件。

目前檢測大腸桿菌O157：H7 的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學和分子生物學檢測[7-9]。這些方法在不同的檢測要求下都有各自的優(yōu)點，也都存在不足，比如耗費時間長，操作過程繁瑣及檢測靈敏度低等。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)自2000年日本科學家Notomi 發(fā)明以來[10]，因其可在等溫條件下數(shù)十分鐘內(nèi)完成核酸的高倍擴增，從而成為繼PCR 技術(shù)之后又一新型快速、 簡便的分子生物學檢測技術(shù)。目前各國研究人員在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種病原菌的LAMP 檢測方法，比如副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）[11]、沙門氏菌[12]、人乳頭瘤病毒（HPV16）[13]、副溶血性弧菌[14]等。與PCR 等其它方法相比，LAMP 有獨特的優(yōu)點，如在等溫條件下即可完成擴增反應，反應時間短 （40～60 min），靈敏度較高，反應溫度較低（60～65 ℃），甚至可肉眼直接判斷反應結(jié)果[15]。

許多研究表明，食品中存在多種水溶性DNA聚合酶抑制劑，會干擾PCR 等分子生物學方法檢測食品中致病菌。活性炭是一種具有較大表面積、復雜孔隙結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，具有良好的吸附性能，可以用來消減干擾PCR 聚合酶活性的抑制劑[16]。由于活性炭同時能吸附細菌，所以需對其表面進行適當封閉，從而防止細菌被吸附。據(jù)文獻[17]報道，使用蒙脫石封閉的活性炭可以消減食品中抑制劑，不影響食品中細菌的回收。

Midori Green 是一種新型的核酸熒光染料，具有靈敏性高，毒性低，安全性好的優(yōu)點，而利用該染料進行實時熒光定量LAMP 法 （Rti-LAMP）的報道不多[18]。本研究采用Midori Green 為核酸染料，建立大腸桿菌O157：H7 的Rti-LAMP 檢測技術(shù)；通過模擬雞肉污染大腸桿菌O157：H7，建立基于Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中的大腸桿菌O157：H7 并與國標檢測法進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌O157：H7 ATCC BAA-708 菌株，本實驗室保存；雞脯肉樣品，市場購買；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、EC 肉湯等，青島高科園海博科技有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），美國Difco 公司；Bst DNA polymerse，新西蘭Biolabs 公司；Midori Green，dNTPs，Bulldog Bio公司；2×Taq Master Mix，上海欣百諾生物科技有限公司；Whirl-Pak 均質(zhì)過濾袋，美國Nasco 公司；八 連 管，BIO-RAD；Activated carbon （Filtrasorb 200），美國Calgon Carbon 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

拍擊式均質(zhì)機，AES chemuex 公司；紫外可見分光光度計（WFZ-UV-2100），尤尼科（上海）儀器有限公司；GL-21M 高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XB-150B 全自動雪花制冰機，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，法國Vibler Lourmat 公司；電泳儀（EPS300）、電泳槽（VE-180），上海天能科技有限公司；熒光PCR 儀，CFX Connect Real-time System，BIORAD。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 針對大腸桿菌 O157：H7 （VT2）基因，參考Hara-Kudo 等[19]設(shè)計了6 條特異性引物用于Rti-LAMP，包括兩條內(nèi)引物（FIP/BIP），兩條外引物（F3/B3），兩條環(huán)引物（Loop F/ Loop B），詳見表1。引物由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 細菌培養(yǎng)、計數(shù)及細菌DNA 提取 將活化的大腸桿菌O157：H7 接種于3 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min 過夜培養(yǎng)16～18 h，以3%菌液量轉(zhuǎn)接于10 mL TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)1.5 h 左右至對數(shù)期細菌（OD600≈0.5）。將菌液用滅菌的生理鹽水按10 倍梯度依次稀釋，取100 μL 涂于平板，培養(yǎng)18～24 h 細菌計數(shù)，測定OD600的數(shù)值，建立OD600值與菌濃度的標準曲線。

細菌總DNA 制備，生理鹽水稀釋的細菌500 μL 加入500 μL 2×TZ 裂解液[20]，于99.5 ℃下加熱10 min，冰上冷卻后高速離心5 min，取上清即為細菌DNA 模板。

表1 LAMP 引物Table 1 Primers used in the Rti-LAMP

1.3.3 Rti-LAMP 反應 Rti-LAMP 反應體系總體積 為25 μL：2.5 μL 10×buffer，5 μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 12.5 mmol/L dNTPs，2 μL 20 mmol/L FIP，2 μL 20 mmol/L BIP，0.4 μL 20 mmol/L F3，0.4 μL 20 mmol/L B3，1.2 μL 20 mmol/L Loop F，1.2 μL 20 mmol/L Loop B，1 μL 1 ∶500 稀釋的熒光染料Midori Green，0.9 μL Bst 聚合酶，2 μL DNA 模板，無菌去離子水補足至25 μL。制備好的反應管放入BIO-RAD CFX Connect Real-time System 內(nèi)65 ℃擴增反應60 min。每分鐘讀取熒光數(shù)值，設(shè)定樣品熒光值出現(xiàn)指數(shù)增加的時間為Tp值（類似于Rti-PCR 的Ct 值）[21-22]，測定Tp 值與細菌濃度之間關(guān)系函數(shù)。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 Rti-LAMP 產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，將1 μL 的Midori Green 原液加入到20 mL 瓊脂糖凝膠后進行電泳。電泳條件為：電壓80 V，電流60 mA，時間35 min，取出置于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.3.5 蒙脫石封閉活性炭（BCAC）的制備 16 g活性炭用蒸餾水沖洗至流水無色，放入烘箱烘干待用。取蒙脫石4 g 加蒸餾水200 mL，振蕩搖勻至完全溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL 離心杯中室溫下700 r/min，1 min，將上清液倒入加了上述活性炭的三角瓶中，37 ℃下150 r/min，振蕩3 h。然后轉(zhuǎn)移到55℃烘箱中烘干備用。

1.3.6 模擬大腸桿菌O157：H7 污染雞肉樣品 取25 g 經(jīng)國標檢測大腸桿菌O157：H7 陰性的雞肉樣品，置于裝有75 mL PBS（50 mmol/L）緩沖液的Whirl-Pak 均質(zhì)過濾袋中，加入生理鹽水稀釋至適宜濃度的大腸桿菌O157：H7 0.5 mL，以制備濃度為0，140，450，1 400，4 500，14 000，45 000 CFU/g的人工模擬污染樣品，將均質(zhì)袋置于均質(zhì)機中，37℃下拍打1 min，隨后放入37 ℃的水浴增菌4 h。樣品過濾液轉(zhuǎn)移至離心杯中，800 r/min 離心5 min，上清液通過含0.5 g 玻璃棉的滅菌注射器過濾，取過濾液用于樣品中細菌DNA 的提取。

1.3.7 封閉活性炭對雞肉樣品前處理 模擬大腸桿菌O157：H7 污染雞肉樣品的步驟見1.3.6 節(jié)，但不經(jīng)過增菌培養(yǎng)。濾液轉(zhuǎn)移至離心杯中，10 000 r/min 離心5 min，除去上清，用30 mL PBS（50 mmol/L）緩沖液重懸，加入4 g 制備的BCAC，37℃150 r/min 振蕩15 min，用含0.2 g 玻璃棉的滅菌注射器過濾，取過濾液用于樣品中細菌DNA 的提取。

1.3.8 樣品中細菌DNA 的提取 將過濾液于10 000 r/min 下離心5 min，棄上清，沉淀重懸于0.5 mL 生理鹽水，加入等體積2×TZ 裂解液，混勻后于99.5 ℃下加熱10 min，冰浴2 min 后12 000 r/min 離心10 min，上清即為樣品DNA 模板，取2 μL 作為Rti-LAMP 反應模板。

1.3.9 臨床雞肉樣品的對比檢測 從市場上購買51 份冷凍雞肉樣品，利用增菌Rti-LAMP、封閉活性炭預處理未增菌的Rti-LAMP 和國標法（GB 4789.38-2012 食品安全國家標準食品微生物學檢驗），同時檢測這些雞肉樣品中大腸桿菌O157：H7污染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌O157：H7 的Rti-LAMP 檢測方法建立

以大腸桿菌 O157：H7 裂解液為模板，結(jié)合Midori green 核酸熒光染料，通過設(shè)計的6 條特異性引物進行Rti-LAMP 反應，其結(jié)果顯示陽性樣品在30 min 之內(nèi)出現(xiàn)熒光值呈指數(shù)增加，而陰性樣品則沒有熒光指數(shù)增加現(xiàn)象。為測定Rti-LAMP的靈敏度，設(shè)置了0，1.1，3.5，11，35，110，350 CFU/管，共7 個梯度，結(jié)果表明3.5 CFU/管可穩(wěn)定擴增檢出，低于該濃度則檢出穩(wěn)定性不夠，故該Rti-LAMP 的檢測靈敏度為3.5 CFU/管（圖1）。以熒光值500 作為衡量各反應熒光指數(shù)增加出現(xiàn)的時間（Tp 值），以Tp 值為縱坐標，lg（CFU/管）為橫坐標，則細菌CFU 與Tp 值之間的線性回歸方程為Y=-2.1632X+22.655，決定系數(shù)R2=0.9896，表明在3.5～350 CFU/管范圍內(nèi)，其細菌濃度與其相應的Tp 值具有良好的線性關(guān)系，通過Rti-LAMP的Tp 值可實現(xiàn)定量檢測大腸桿菌O157：H7（圖1）。大腸桿菌O157：H7 的Rti-LAMP 擴增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示，典型LAMP 擴增產(chǎn)物是一系列梯度的DNA 片段混合物，在電泳圖上呈現(xiàn)出規(guī)律的梯狀條帶，表明本研究建立的Rti-LAMP 法檢測大腸桿菌O157：H7 具有良好的特異性。

圖1 典型Rti-LAMP 擴增大腸桿菌O157：H7 熒光曲線及Tp 值與lg（CFU/反應）的線性回歸方程Fig.1 Rti-LAMP plots and linear detection plot of E.coli O157：H7 derived from various numbers of log phase E.coli O157：H7 cells

2.2 增菌前處理的Rti-LAMP 檢測人工模擬大腸桿菌O157：H7 污染的雞肉樣品

為研究Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157：H7 的靈敏度和特異性，本研究人工模擬大腸桿菌O157：H7 污染雞肉樣品，經(jīng)37 ℃增菌4 h后，提取樣品DNA 進行Rti-LAMP 檢測。結(jié)果表明，Rti-LAMP 能穩(wěn)定檢測140 CFU/g 的樣品，顯示該方法檢測靈敏度為140 CFU/g（圖3），整個檢測時間約為7 h。以Tp 值為縱坐標，lg（CFU/g）為橫坐標，建立的線性回歸方程為：Y=-3.9792X+31.218，決定系數(shù)R2=0.9504，表明本研究增菌前處理的Rti-LAMP 具有定量分析檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157：H7 的污染程度（圖3）。如圖4所示，擴增產(chǎn)物與純菌擴增產(chǎn)物的電泳條帶完全一致，說明該方法檢測雞肉中大腸桿菌O157：H7 特異性良好。

圖2 Rti-LAMP 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions by agarose gel electrophoresis

圖3 Rti-LAMP 檢測模擬大腸桿菌O157：H7 污染的雞肉樣品的擴增曲線及Tp 值與lg（CFU/g）的線性函數(shù)Fig.3 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP and linear detection plot of E.coli O157：H7 derived from various numbers of seeded chicken

圖4 模擬污染的雞肉樣品Rti-LAMP 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in samples filtrate of chicken by agarose gel electrophoresis

2.3 封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測人工模擬E.coli O157：H7污染的雞肉樣品

封閉活性炭的用量經(jīng)本實驗室優(yōu)化[23]后，確定處理每份樣品的用量為4 g。使用封閉活性炭處理人工模擬污染大腸桿菌O157：H7 的雞肉樣品，不經(jīng)過增菌步驟，提取樣品DNA 進行檢測。結(jié)果表明，使用封閉活性炭處理后的Rti-LAMP 能穩(wěn)定檢測出12 CFU/g 的雞肉樣品（圖5），表明經(jīng)封閉活性炭預處理的Rti-LAMP 較增菌前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度提高約10 倍。3 次重復試驗，以Tp 平均值為縱坐標，lg（CFU/g）為橫坐標，線性回歸方程為：Y=-3.1888X+24.684，決定系數(shù)R2=0.9905，說明在12～4 000 CFU/g 范圍內(nèi)具有良好的可定量分析特性。

圖5 經(jīng)活性炭處理后Rti-LAMP 的擴增曲線及Tp 值與lg（CFU/g）的線性函數(shù)Fig.5 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP after activated carbon treated and linear detection plot of E.coli O157：H7 derived from various numbers of seeded chicken

2.4 3 種方法對比檢測臨床雞肉樣品

使用上述建立的兩種大腸桿菌O157：H7 的Rti-LAMP 方法和國標法進行對比檢測分析，對市場上購買的51 份冷凍雞肉樣品進行大腸桿菌O157：H7 檢測，檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，增菌前處理的Rti-LAMP 和國標法，均檢測到1 份大腸桿菌O157：H7 陽性樣品，且為同一份雞肉樣品；而使用封閉活性炭預處理的Rti-LAMP 法，還檢測到另外7 份陽性樣品（共8 份）。因此，本研究建立的雞肉樣品中大腸桿菌O157：H7 增菌前處理的Rti-LAMP 檢測方法與國標法靈敏度相當，而使用封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測方法則具有更高的檢測靈敏度，且檢測時間極大地縮短至4.5 h 左右。

表2 3 種檢測方法對臨床雞肉樣品中大腸桿菌O157：H7 的檢測結(jié)果Table 2 Three methods detected clinical chicken samples for E.coli O157：H7

為驗證臨床雞肉樣品大腸桿菌O157：H7 Rti-LAMP 檢測的特異性，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖6），結(jié)果DNA 擴增條帶與大腸桿菌O157：H7 純菌擴增條帶一致，表明本研究建立的Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157：H7 具有良好的特異性。

圖6 臨床雞肉樣品Rti-LAMP 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Detection of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in clinical samples of chicken by agarose gel electrophoresis

3 討論

本研究根據(jù)大腸桿菌O157：H7 的VT2 基因設(shè)計了6 條特異性引物，結(jié)合Midori Green 新型核酸染料，建立了大腸桿菌O157：H7 的Rti-LAMP 檢測方法，其中純培養(yǎng)菌液靈敏度達到3.5 CFU/反應，模擬大腸桿菌O157：H7 污染的雞肉樣品中增菌前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度為140 CFU/g，整個檢測流程可在7 h 內(nèi)完成；而經(jīng)封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度為12 CFU/g，需時約4.5 h 左右。

檢測的51 份臨床雞肉樣品，增菌前處理的Rti-LAMP 方法和國標法檢出率均為1.96%。據(jù)Zhang 等[5]對中國南方多個省市183 份雞肉污染情況調(diào)查，結(jié)果大腸桿菌O157：H7 的陽性檢出率為3.28%。這與本試驗的檢測結(jié)果大致相似，表明Rti-LAMP 與國標法具有相同的檢測靈敏度，但Rti-LAMP 所需時間約7 h，可在一個工作日內(nèi)完成，較國標法節(jié)省了時間和人力。

研究表明，由于食品成分的復雜性，其中存在著多種水溶性DNA 聚合酶抑制劑，對檢測的靈敏度和穩(wěn)定性產(chǎn)生很大的影響[16]。例如本研究中未經(jīng)封閉活性炭處理的Rti-LAMP 對模擬污染的雞肉樣品進行檢測，其線性函數(shù)的R2系數(shù)較低（0.9504），顯示食品組分中的抑制劑對擴增反應有一定的影響。本研究嘗試使用蒙脫石封閉的活性炭進行前處理以消減抑制劑，結(jié)果表明經(jīng)封閉的活性炭前處理人工模擬大腸桿菌O157：H7 污染的雞肉樣品，相比增菌但未使用封閉活性炭處理的Rti-LAMP 方法靈敏度提高了約10 倍。封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢出臨床雞肉樣品8份大腸桿菌O157：H7 陽性，進一步說明該方法檢測靈敏度確實有很大的提高，同時不需要增菌，極大地縮短檢測至4.5 h。封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 法檢出雞肉樣品大腸桿菌O157：H7 高陽性率，推測可能的原因主要有兩點：一是雞肉中污染的大腸桿菌O157：H7 濃度并不低，但由于食品在加工儲藏過程中會對細菌造成抑制和損傷，導致細菌活力降低甚至死亡，增菌培養(yǎng)時，損傷細菌不易生長繁殖，從而影響了國標法的檢出率；但由于Rti-LAMP 法是對目標菌DNA 的擴增檢測，損傷細菌其DNA 可以作為擴增模板；二是封閉活性炭消減雞肉中可溶性抑制劑效果好，解除了抑制劑對DNA 聚合酶的抑制作用，從而極大地提高了Rti-LAMP 檢測靈敏度。國家食品安全標準（GB 29921-2013）中規(guī)定，同一批次的5 份樣品中大腸桿菌O157：H7 的檢出率為0，說明對大腸桿菌O157：H7 有著嚴格的限定標準，所以嚴格控制大腸桿菌O157：H7 的檢出對于保障食品安全具有重要意義。當然，本研究建立的Rti-LAMP 方法無法區(qū)別目標菌是死菌還是活菌，如何利用分子生物學方法進行鑒別，實現(xiàn)臨床樣品致病菌更精準的檢測，仍需進一步研究。