東北膜莢黃芪內生細菌的分離及其活性代謝物分析

翟李欣 徐慧超 李 偉 鄭 雪 鄭春英*

（1 黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心 哈爾濱150500 2 黑龍江大學生命科學學院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室 哈爾濱150080）

植物內生菌是具有豐富多樣性特征的微生物類群，幾乎存在于每種植物的不同組織器官內。據統計，自然界中至少存在著一百萬種內生菌[1]。內生菌的多樣性表現以下幾個方面：同種植物的不同部位，在其組織內所生長的內生菌的種類及數目不同[2]；同種植物在不同生理、病理狀態下，其內生菌種類及數目也會相應發生改變[3]；產地、氣候等環境因素直接影響內生菌種類及數目[4-5]。植物內生菌次生代謝產物的多樣性是受其宿主植物中內生細菌的多樣性所決定[6]。據報道[7-8]，從植物內生菌中分離得到的次生代謝產物有49%是已知結構化合物，51%是新結構類型的化合物。植物內生菌是一種新型生物活性物質資源，研究植物內生細菌具有重要的理論意義和較高的商業應用價值。

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.）的干燥根[9]，主要分布于東北與西北等地，分布于東北的膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.）品系簡稱“北芪”[10]，具有抑菌[11]、抗炎[12]、抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15]、降血糖[16]等多種活性作用。

寒地黑土造就了東北膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）特有品質，現被廣泛應用于功能性保健食品、 食品添加劑、 藥品等領域。本文以主產于東北地區的膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）（北芪）為研究對象，對其內生細菌進行分離及活性代謝物初步研究，并與生藥活性成分作對比分析，篩選出能夠產與宿主植物北芪相同、相似或全新的具有抑菌、抗氧化等實用價值的目的菌株，為開發新資源、創制新藥、 開辟新型北芪活性成分的生產方法奠定基礎。

1 材料

1.1 植物樣品

野生豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.健康植株分別于2015年8，9月采自黑龍江省大興安嶺地區。

1.2 培養基

NA 分離培養基及PDA 培養基：同文獻[17]。

1.3 試驗菌株

糞腸球菌 （Enterococcus facalis）、 屎腸球菌（Enterococcus faecium）、金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、 銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）、單增李斯特菌 （Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、肺炎克雷 伯菌（Klebsiella penumoniae）、白假絲酵母（Candida albicans），均購于黑龍江省應用微生物研究所。

1.4 儀器與試劑

高效液相色譜儀（FL2200 HPLC，浙江溫嶺）；電子天平（METTLER TOLEDO，美國）。

16SrDNA 序列擴增引物（上海生工生物工程股份有限公司合成），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 北芪內生細菌的分離

將北芪根、莖樣品沖洗，剝取韌皮部，按下述程序進行表面消毒：75% 乙醇浸1min→5% NaCl 浸5min→75%乙醇浸360 s→無菌水沖洗3 次→10%H2O2浸15 min→浸于75%酒精1 min→無菌水沖3 次。將根、 莖韌皮部切成1 cm 的小塊（無菌操作），置于NA 液體分離培養基中，放入水浴搖床；同時，也將其置于NA 固體分離培養基中的樣品放入培養箱中，培養條件均為：37 ℃；培養3～5 d。觀察，待根、莖小塊四周長出菌體后，將菌體轉入平板，多次劃線分離純化；另取表面消毒程序最后沖洗樣品的無菌水液倒入NA 液體培養基，或涂布平板培養作對照，以排除所分離得到的內生細菌為殘留在樣品表面的菌株。

2.2 抑菌試驗

2.2.1 北芪內生細菌發酵產物的制備 取分離得到的北芪內生細菌，活化后分別接種于含有50 mL NB 培養基的三角瓶中（n=3），于37 ℃，120 r/min 搖床培養3d，取出，作為北芪內生細菌供試品液（1×107CFU/mL）。以20%的裝液量將上述北芪內生細菌供試品液接種于新配制NB 培養基中，同等條件下發酵培養5 d，取出，抽濾，濾液醇沉（3倍量95%乙醇，V/V），取上清液，回收溶劑后作為北芪內生細菌發酵產物備用。

2.2.2 抑菌試驗 取2.1 節的北芪內生細菌發酵產物以等量的水飽和正丁醇超聲1h，于50℃條件下，將正丁醇提取液減壓濃縮后，用1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液，參閱文獻[18]，按濾紙片法操作進行抑菌活性測定。

2.3 北芪內生細菌活性代謝物分析

2.3.1 HPLC 分析條件 色譜柱：Venusil XBPC18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（50 ∶49.7 ∶0.3）流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：254nm；進樣量：10μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取芒柄花素對照品適量，用甲醇稀釋溶解，制成質量濃度為0.5 mg/mL 對照品溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液制備 取2.1 節北芪內生細菌發酵產物（n=6），分別以等量的乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取，各萃取液減壓（50 ℃水浴條件下）濃縮近干，加入1 mL 甲醇溶解，于4 ℃保存，備用；同時，另取NB 培養基同法操作后作為空白對照品溶液；另取北芪生藥3 g，精密加入甲醇50 mL，超聲提取1 h，取出，放冷，濾過，濾液濃縮至5 mL 后作為對照藥材液，備用。

2.3.4 樣品測定 依照3.1 節的色譜條件，分別精密吸取對照品液、對照藥材液、供試品液、空白對照液各10 μL（n=3）進樣，檢測。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態學觀察及生理生化鑒定 參照文獻[19]。

2.4.2 16 S rDNA 序列擴增和序列分析 北芪內生菌按照常規方法[20]進行PCR 擴增。采用16S rDNA 通用引物為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 產物純化后測序（委托上海生工生物工程股份有限公司）。序列提交GenBank 數據庫，在GenBank 網站上用Blast 軟件進行相似性搜索，得到相近典型菌株的16S rDNA 基因序列后，用軟件MEGA6.0 進行多重序列比對，構建系統進化樹，分析結果并確定菌株的分類地位。

3 結果

3.1 北芪內生細菌的分離

從健康北芪根部組織、 莖部組織中共分離出36 株內生細菌，其中，從莖中分離得到16 株，從根中分離得到20 株。

3.2 內生細菌的抑菌活性

在所分離得到的36 株北芪內生細菌中，有31 株內生細菌發酵液對11 株供試致病菌具有不同程度的抑菌作用，占分離菌株的86.11%，北芪內生細菌抑菌活性篩選結果見表1。

表1 北芪內生細菌發酵液抑菌試驗結果Table 1 Antimicrobial activities of endophytic bacteria isolated from Astragalus membranaceus to the tested bacteria and fungi in screening

3.3 北芪內生細菌活性代謝物分析結果

3.3.1 色譜條件下活性成分的分離 在3.1 節的色譜條件下，對照藥材液中各物質得到了較好的分離，其中北芪根對照藥材液在與對照品芒柄花素相同保留時間處出現一相同色譜峰，該色譜峰采用對照品加入法確認為芒柄花素，結果見圖1。

圖1 北芪生藥與對照品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of Astragalus membranaceus and reference substance

3.3.2 北芪內生細菌活性代謝物分析結果 采用HPLC 法分析36 株北芪內生細菌發酵液不同極性部位，發現內生細菌HX8 及HX14 發酵液中含有大量活性物質，并且內生細菌HX8、HX14 在與對照品及對照藥材對比分析后發現，該菌株可能含有北芪活性成分芒柄花素，結果見圖2及圖3。

由圖2可以看出，在保留時間10～12min 時，內生細菌HX8 發酵液經乙酸乙酯、氯仿萃取所得的供試品液出現與北芪根、 莖生藥樣品相同的色譜峰；在保留時間18 min 左右時，內生細菌HX8發酵液經乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現與北芪莖生藥樣品相同的色譜峰；由圖2和圖3可以看出，在保留時間44min 時，內生細菌HX8、HX14發酵液經乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現與北芪根生藥樣品的活性成分——芒柄花素，上述試驗結果說明，內生細菌HX8、HX14 發酵液中含有與北芪生藥相同或相似的活性成分，該檢測結果對深入研究北芪內生細菌HX8、HX14 活性成分提供參考。

圖2 北芪內生細菌HX8 發酵液的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX8

3.4 菌種鑒定

據抑菌試驗結果及HPLC 法對36 株北芪內生細菌活性代謝物分析結果，對具有潛在應用價值的北芪內生細菌HX8 進行了菌種鑒定。

3.4.1 形態學觀察及生理生化鑒定結果 北芪內生細菌HX8 形態學觀察及生理生化鑒定結果見表2。

3.4.2 16S rDNA 鑒定結果 北芪內生細菌HX8 PCR 擴增后獲得1 條1 000 bp 左右的特異性條帶，將測序結果利用BLAST 分析并與GenBank中的核苷酸序列進行比對，然后用MEGA6.0 軟件構建北芪內生細菌HX8 的系統發育樹（見圖4），分析其種屬關系。分析結果表明，HX8 序列（登錄號：KY010575）與甲基營養型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus strain MPF 15 的16S rDNA 序列的同源性最高，相似性為99%。結合菌體形態特征、生理生化鑒定結果確定菌株HX8 為枯草芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

4 討論

圖3 北芪內生細菌HX14 發酵液的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX14

表2 北芪內生細菌HX8 形態學觀察及生理生化鑒定結果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics for strain HX8

圖4 HX8 菌株的系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain HX8

以東北寒地藥用植物膜莢黃芪（北芪）為研究對象，對其根、莖中的內生細菌進行了分離，并以抑菌活性為指標，對所分離得到的北芪內生細菌次生代謝產物進行抑菌活性篩選，以便能夠得到產生較好抑菌活性物質的目的菌株，為開發新型防腐劑及新型抗菌藥物提供參考；同時，以芒柄花素及北芪生藥為對照，采用HPLC 法對北芪內生細菌次生代謝產物進行對比分析；結果表明，在36 株北芪內生細菌次生代謝產物中，存在著大量具有較好抑菌作用的活性物質，其中北芪內生細菌HX8，HX14 代謝物表現出了較好的抑菌活性，同時經HPLC 比對分析發現，此2 株內生細菌發酵液中活性物質可能含有與北芪生藥活性成分相同或相似，是北芪活性成分產生菌，因此對此2株內生細菌中具有潛在應用價值的HX8 進行了菌種鑒定，為該菌株的深入研究奠定基礎。

以芒柄花素為代表的黃酮類成分為黃芪主要活性成分之一[21]，其中芒柄花素具有降壓、抗癌及抗菌作用，是常用的藥物原料[22]，本文以芒柄花素及北芪生藥為陽性雙對照，對北芪內生細菌發酵液進行篩選，結果表明2 株北芪內生細菌HX8，HX14 發酵液中疑似含有芒柄花素，該結果對后續課題組采用柱色譜法分離此2 株目的細菌活性成分奠定基礎；同時，也為采用微生物發酵法生產芒柄花素成分提供理論依據。此外，對北芪內生細菌發酵產物進行系統篩選研究，發掘出北芪活性成分產生菌，并對其進行綜合利用，這對開發新資源、 采用微生物發酵法生產北芪活性成分及保護北芪藥用植物可持續利用具有重要意義。