高效液相色譜法測定卡馬西平9個雜質方法的評價

王 宇 陳運動 高 政

1.江蘇天士力帝益藥業有限公司，江蘇淮安 223002；2.江蘇慈星藥業有限公司，江蘇宿遷 223800

卡馬西平（Carbamazepine）是抗癲癇的常用藥物，是癲癇精神運動型發作和三叉神經痛的首選藥物。在卡馬西平的有關物質控制方面，中國藥典與各國外藥典均使用氰基色譜柱。在CP、USP與EP的色譜條件方法下，運用高效液相法檢驗時，卡馬西平主峰與EP藥典規定雜質A以及雜質B與雜質D之間的分離度達不到合格要求。參考文獻[1-7]方法，現建立此有關物質的HPLC分析方法，對其驗證，證明其方法專屬性強，準確可靠。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AUW120D型電子天平（日本島津公司），SQP型電子天平（賽多利斯公司），安捷倫1260型高效液相色譜儀，沃特世2695/2998型高效液相色譜儀。

1.2 試劑試藥

甲醇色譜純（美國 TEDIA 公司，17125121），乙腈色譜純（美國 TEDIA 公司，18035024），甲酸分析純（上海蘇懿化學試劑有限公司，20170203），三乙胺分析純（國藥集團，20160323），雜質A對照品（Lot：016326.0，含 量：99.98%，European），雜質 B對照品（Lot：AJ-028-24，含 量：99.22%，Aocs），雜 質 C 對 照 品（Lot：ESC-037-26，含 量：99.91%，Aocs），雜質 D 對照品（Lot：1205821，含量：98.76%，REFERENCE），雜 質 E對 照品（Lot：AJC-058-24，含量：99.83%，Aocs），雜 質 F對 照品（Lot：AJC-058-25，Aocs），雜質 G 對照品（Lot：AJC-118-25，含量：99.08%，Aocs），酰氯亞氨基二芐（Lot：2018051301，含量：99.64%，江蘇慈星藥業有限公司），卡馬西平（Lot：Y201801003，江蘇慈星藥業有限公司）。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

流動相A：1000mL水中加三乙胺0.5mL甲酸0.5mL，混勻抽濾；流動相B：1000mL乙腈中加甲酸0.25mL，混勻，抽濾，按下述梯度條件測試。見表1。

檢 測波 長：230nm，流速：1.0mL/min，進樣量：20μL，柱溫：30℃；色譜柱：月旭XS-C18（4.6mm×250mm，5μm）。

表1 流動相梯度洗脫明細表

表2 降解試驗物料平衡考察結果

2.2 測定法

溶液配制。供試品溶液：取本品適量，精密稱定，用甲醇-水（1∶1）定容，制成0.5mg/mL。

對照溶液：取供試品溶液2～50mL容量瓶，加甲醇-水（1∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）稀釋至刻度。

對照品儲備液：取酰氯亞氨基二芐、雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G對照品各20mg，精密稱定，分別置100mL量瓶中，加甲醇50mL溶解后，用水稀釋至刻度，分別制成每1mL中約含200μg的雜質儲備溶液。

對照品定位溶液：分別精密移取雜質A、雜質E對照品儲備液0.75mL，酰氯亞氨基二芐，、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F、雜質G對照品儲備液0.5mL，分別置100mL量瓶中用稀釋劑定容。在分別移取5mL到10mL量瓶中用稀釋劑定容（雜質A，雜質E為0.75μg/mL，酰氯亞氨基二芐、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F、雜質G為0.5μg/mL）。

對照品混合溶液：分別精密移取雜質A、雜質E 對照品儲備液0.75mL，酰氯亞氨基二芐、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F、雜質G對照品儲備液0.5mL，置同一100mL量瓶中用稀釋劑定容。在移取5mL到10mL量瓶中用稀釋劑定容。

系統適用性溶液：分別精密移取雜質A、雜質E對照品儲備液0.75mL，酰氯亞氨基二芐、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F、雜質G對照品儲備液0.5mL，供試品儲備液25mL，置同一100mL量瓶中用稀釋劑定容。在移取5mL到10mL量瓶中用稀釋劑定容。

精密量取系統適用性溶液、對照品混合溶液、供試品溶液、對照溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。系統適用性溶液中各雜質分離度要≥1.5，供試品溶液中如有與對照品溶液中雜質保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算。

2.3 專屬性

分別取本品50mg，精密稱定，置50mL量瓶中，用溶劑甲醇-水（1∶1）稀釋，在強堿、強酸、強氧化、高溫條件下破壞后，室溫放置24h；在光照條件下破壞5d進行強降解實驗。同法制備相應破壞的空白溶液。精密量取各降解實驗溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，報告溶劑對檢測的干擾，報告系統適用性溶液中雜質的分離情況，計算物料平衡。試驗結果表明溶劑不干擾其他雜質和主成份檢測，對照品混合溶液中各雜質間分離度＞1.5。強制降解試驗中主要降解產物的峰純度合格，物料平衡在90%～110%之間。見表2、圖1。

圖1 分離度色譜圖

2.4 檢測限與定量限

精密量取檢測限溶液和定量限溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見表3。

表3 檢測限、定量限結果（μg/mL）

2.5 線性范圍

配制每1mL中各約含10μg的對照品儲備液。取對照品儲備溶液配制各雜質項下線性溶液，各精密量取20μL，注入液相色譜儀。記錄各濃度的色譜峰面積，以峰面積A對濃度C（μg/mL）進行線性回歸，得出各雜質的線性回歸方程，線性范圍。雜質A為0.5395～3.2370μg/mL（y=20.012x+0.794，r=0.9962，n=6），雜質 B 為 0.4985～ 2.9910μg/mL（y=60.679x+1.2167，r=0.9995，n=6），雜 質 C 為0.5075～ 3.0450μg/mL（y=67.349x-0.8307，r=0.9995，n=6），雜質 D 為 0.5080～ 3.0480μg/mL（y=89.659x-4.208，r=0.9999，n=6），雜 質 E為 0.5050～ 3.0300μg/mL（y=32.231x+3.8737，r=0.9973，n=6），雜質 F1為 0.4950～ 2.9700μg/mL（y=62.706x+0.7887，r=0.9998，n=6），雜 質 F2 為0.4950～ 2.9700μg/mL（y=14.772x+3.0857，r=0.9962，n=6），雜質 G 為 0.5180～ 3.1080μg/mL（y=61.868x+6.2873，r=0.9986，n=6）， 雜質酰氯亞氨基二芐為0.5080～3.0480μg/mL（y=32.855x+1.1273，r=0.9986，n=6），各雜質線性方程的相關系數R2≥0.990，y軸截距在100%響應值的25%以內，線性良好。

2.6 準確度

溶液配制：

對照品儲備液1：用甲醇-水（1∶1）稀釋，制成每1mL中含雜質A和雜質E各約10μg的對照品儲備液。

對照品儲備液2：用甲醇-水（1∶1）稀釋，制成每1mL中各約含10μg的酰氯亞氨基二芐、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F和雜質G對照品儲備液。

樣品溶液：取本品50mg，精密稱定，置50mL量瓶中，精密稱定，加甲醇25mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中約含卡馬西平1mg的供試品溶液。

準確度溶液：取本品50mg，精密稱定，置50mL量瓶中，按限度水平50%、100%、150%的相應濃度，精密量取雜質對照品儲備液1和雜質對照品儲備液2，分別加入各已有樣品的量瓶中，加甲醇25mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。每濃度水平的準確度溶液平行配制3份。

測定：精密量取上述溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別計算各個濃度水平的單個和平均回收率和相對標準偏差，各濃度3份溶液中單個和平均回收率在90%～110%之間；相對標準偏差（RSD）≤10%。

2.7 精密度

重復性試驗取準確度項下溶液，參考文獻[8-11]方法，重復進樣6次，各雜質對標準偏差（RSD）均≤8%。中間精密度試驗為不同研究員，在不同日期，使用不同液相色譜儀，按重復性試驗同法操作，各雜質相對標準偏差（RSD）均≤10%。

2.8 耐用性

取雜質儲備液、對照品混合溶液和供試品溶液，對照溶液，于室溫條件和冷藏條件下放置，參考文獻[12-15]方法，在一定的時間間隔取樣測定，計算雜質儲備液、對照品混合溶液在不同穩定性時間點各峰面積，計算待測物質峰面積RSD，比較供試品溶液在各穩定性時間點的雜質檢出情況。

改變色譜條件：與正常條件相比較，在改變色譜柱溫度為 25℃、35℃、流速 0.9mL/min、流速1.1mL/min以及更換色譜柱條件下，考察供試品溶液中雜質的變化。對照品儲備液、對照品溶液穩定性在相應穩定性時間點峰面積相對標準偏差（RSD）均≤5%，雜質＜0.2%，絕對差值在±0.05%，雜質檢出個數沒有差異。

3 討論

通過對此卡馬西平有關物質方法的驗證，各項驗證數據均符合中國藥典標準規定，從而證明此方法在準確度、專屬性、耐用性等方面表現良好。目前，各個國家藥典中均選用氰基色譜柱，當氰基柱在使用四氫呋喃做流動相時，色譜柱的壽命很短，且長期使用柱效下降。其中，USP方法為超高效液相法，對儀器儀器與耗材要求嚴格，成本較高。而運用CP方法與EP方法高效液相檢驗時，卡馬西平主峰與雜質A以及雜質B與雜質D之間的分離度達不到合格要求，不能實現所有雜質的分離，導致雜質限度檢驗不準確。此有關物質的HPLC檢查方法，方法專屬性強，準確可靠，建議中國藥典采用此方法進行卡馬西平有關物質檢查。