時間分辨熒光免疫法檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應用研究

賴玉玲 黃麗芳 雷 興

1.廣東省韶關市第一人民醫院檢驗科，廣東韶關 512000；2.廣東省韶關市第一人民醫院皮膚性病科，廣東韶關 512000

梅毒（syphilis）是由蒼白密螺旋體（treponema pallidum，TP）引起的細菌感染性疾病，人類是其唯一的傳染源，傳播方式主要是性接觸，血液傳播和垂直傳播[1]。梅毒分期主要有一期，二期，三期和隱性梅毒。根據臨床發現，一期和二期梅毒最具傳染性。目前梅毒的診斷主要依靠實驗室檢測，尤其是血清學檢查（主要有非特異性梅毒螺旋體抗體檢測和特異性梅毒螺旋體抗體檢測），但目前可用的檢測手段不能區分性病梅毒與地方性螺旋體病，容易出現生物學假陽性甚至假陰性的結果[2-3]。隨著醫學檢驗技術的進步，時間分辨熒光免疫法（TRFIA）逐漸被用于臨床多種疾病的檢測當中，本課題旨在通過比較時間分辨熒光免疫法（TRFIA）與梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA）、梅毒螺旋體酶聯免疫吸附試驗（TP-ELISA）在檢測不同時期的梅毒的準確率，探討評價時間分辨熒光免疫法（TRFIA）在梅毒血清學診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

嚴格按照梅毒診斷標準篩選，收集2018年1～8月在本醫院門診或住院接受治療的100例梅毒干擾患者為研究對象，男67例，女33例，年齡19～55歲，平均（37.4±9.2）歲，其中一期梅毒19例，均有硬下疳；二期梅毒23例（11例表現為軀干丘疹、掌部銅紅色脫屑性紅斑；5例為外陰、肛周扁平濕疣；7例為脫發，色素減退斑、礪殼樣痂屑）；三期梅毒10例；隱性梅毒48例。同時選取100例來我院體檢的健康人作為健康對照組，男67例，女33例，年齡19～55歲，平均（35.3±4.1）歲。在征求研究對象的同意之后，簽署《知情同意書》，對其梅毒檢測情況進行回顧性分析。所有人員的平均年齡、病情程度、體質、意識清晰度及醫生操作技術水平等方面基線資料，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入與排除標準[4-5]

納入標準：診斷符合2014年我國疾病預防與控制中心《性傳播疾病臨床診療與防治指南》中梅毒的診斷：（1）疑似病例：同時符合（非梅毒螺旋體血清學試驗陽性）和（既往無梅毒診斷與治療史）項而無臨床表現者；（2）確診病例：同時符合疑似病例的要求和兩類梅毒血清學試驗均為陽性。排除標準：根據研究內容，排除以下三方面的的患者資料：（1）因門診不能耐受治療副反應而住院觀察的首次治療的梅毒患者；（2）入院后未行腰椎穿刺術無腦脊液檢查結果的梅毒住院患者；（3）排除合并因外傷、炎癥、免疫性疾病、HIV感染等引起腦脊液異常的患者以及近3個月內使用糖皮質激素或免疫抑制劑者。

1.3 儀器與試劑

時間分辨熒光免疫法（TRFIA）試劑盒購自蘇州新波生物技術有限公司，應用蘇州新波EasyCuta全自動時間分辨熒光分析儀；梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）試劑盒購自日本富士瑞必歐株式會社；梅毒螺旋體酶聯免疫吸附試驗（TP-ELISA）試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司，應用深圳市匯松發展有限公司生產的MB-530多功能酶標分析儀和PW-960全自動酶標洗板機。

1.4 檢測方法[6-7]

抽取相應患者靜脈血4mL，常規離心分離出血清，分別依據時間分辨熒光免疫法（TRFIA）、梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA）、梅毒螺旋體酶聯免疫吸附試驗（TP-ELISA）的試劑盒說明書并嚴格按照科室SOP文件進行操作，具體如下。

表1 三種檢測方法檢測結果比較[n（%）]

1.4.1 時間分辨熒光免疫法（TRFIA） （1）室溫平衡板條5～10min；（2）微孔板底部加樣本；（3）微孔板底部加生物素標記抗原；（4）室溫孵育45min；（5）洗滌；（6）微孔板底部加EU標記鏈親和素；（7）室溫孵育 15min；（8）洗滌；（9）加增強液；（10）測量熒光計數值。陽性：標本S/CO值≥1。陰性：標本S/CO值＜1。

1.4.2 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA） （1）室溫平衡試劑盒5～10min；（2）于U型微量反應板，每份待測標本標記12個反應孔，第1孔加入100μL血清稀釋液，第2～12孔各加入25μL血清稀釋液；（3）取25μL待測血清加入第1孔中并充分混勻，吸取25μL加入第2孔，如上稀釋，以此類推稀釋至第12孔，最后棄去25μL；（4）在第3孔中加入25μL未致敏顆粒溶液，第4～12孔中各加入25μL致敏顆粒溶液；（5）微量振蕩器上混勻30s；（6）加蓋，室溫靜置2h；（7）觀察結果，統計陽性率和陰性率。陽性反應：第3孔不出現凝集，第4孔開始出現凝集反應。陰性反應：第3孔、第4～12孔均不出現凝集反應。若第3孔出現凝集，實驗無效，需重新檢測。

1.4.3 梅毒螺旋體酶聯免疫吸附試驗（TPELISA） （1）室溫平衡試劑盒 5 ～ 10min；（2）微孔板底部加樣本；（3）37℃避光孵育60mim；（4）洗滌；（5）加酶結合物，繼續避光孵育；（6）洗滌；（7）加底物顯色劑，孵育10mim；（8）加終止液，酶標儀檢測；（9）記錄并判定結果。陽性：標本OD值大于或等于說明書中已設定閾值。陰性：標本OD值小于說明書中已設定閾值。

1.5 觀察指標

觀察健康對照組和各周期梅毒患者的TRFIA、TPPA、TP-ELISA的陽性百分率，比較梅毒患者的TRFIA、TPPA、TP-ELISA的診斷靈敏度、診斷特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比及經濟費用開支進行評價。

1.6 統計學方法

應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗：P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種檢測方法檢測結果比較

根據檢測結果可知，與健康對照組相比：TRFIA、TPPA、TP-ELISA三種方法檢測各周期梅毒患者的陽性百分率明顯升高，說明三種方法均能較好的識別梅毒患者血清中相應抗體；但與TRFIA相比：TPPA、TP-ELISA法對一、二、三周期梅毒的陽性檢出率有所下降、對隱性梅毒的陽性檢出率顯著下降，可以看出時間分辨熒光免疫法（TRFIA）的陽性檢測具有更明顯的效果，經χ2檢驗，TRFIA與TPPA的陽性檢出率差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 三種檢測方法的靈敏度、特異性分析

通過初步比較后得知，TRFIA法的陽性檢測更具優勢，需進一步確認其靈敏度和特異性：靈敏度=梅毒患者中陽性檢測數／梅毒患者總例數×100%；特異性=健康對照組中陰性檢測數／對照組總例數×100%；與TRFIA法比較，TPPA、TP-ELISA法靈敏度下降明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）；特異性差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三種檢測方法的靈敏度、特異性分析

2.3 三種檢測方法的陽性、陰性預測值以及似然比分析

結合三種檢測方法的靈敏度和特異性結果，進一步對其做陰陽性預測值、似然比的分析：陽性預測值=陽性檢測結果中梅毒患者數／檢測為陽性例數×100%；陰性預測值=陰性檢測結果中健康例數／檢測為陰性例數×100%。

陽性似然比=靈敏度／（1-特異性）；陰性似然比=（1-靈敏度）／特異性；與TRFIA法比較：TPPA法的陽性預測值有所增加，差異無統計學意義（P＞0.05）；但陰性預測值卻顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），說明TPPA法雖有較高陽性檢出率，但假陰性較高；與TRFIA法相比：TPELISA法的陽性預測值有所下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。但其陰性預測值顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01），提示其假陰性較高，且陽性檢出率不如TRFIA法。結合似然比，與TRFIA法相比：TP-ELISA的陽性似然比值顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；TPPA、TP-ELISA法的陰性似然比雖然與TRFIA差異無統計學意義（P＞0.05），但均顯著增加，提示其假陰性較高，即TRFIA的真陽性率和真陰性率均更高，診斷效果更好。見表3。

表3 三種檢測方法的陽性、陰性預測值分析（%）

2.4 三種檢測方法的經濟費用評價

匯總三種檢測方法假陰性導致復檢的經濟花費進行統計分析。可知，TRFIA檢測法由于初檢靈敏度高，假陰性率低，所以復檢率低，費用較少；與TRFIA檢測法相比，TPPA法復檢率高，且費用較高，差異有統計學意義（P＜0.01）；TP-ELISA法由于單價較低，雖總體費用未超過TRFIA檢測法，但因其靈敏度低，導致復檢率高，需進行多次復檢，給患者徒增負擔。見表4。

表4 三種檢測方法復檢經濟費用評價

3 討論

梅毒、麻風和結核在過去醫學并不發達的階段被并列稱為世界三大慢性傳染病。其中梅毒因病程長、傳染期長、癥狀時隱時現、多樣復雜、有時臨床表現很不典型，易誤診漏診的特征而導致流行面廣、危害嚴重[8]。一期梅毒又稱早期梅毒，有感染史，潛伏期一般為2～3周，臨床表現為硬下疳和腹股溝淋巴結腫大。二期梅毒為有感染史，可有一期梅毒史，病期2年以內[9]，臨床表現為皮膚出現梅毒疹，口腔有黏膜斑，全身不適及淺表淋巴結腫大[10]。三期梅毒又稱晚期梅毒，一般可有一期或二期梅毒史，病期2年以上，臨床表現常見結節性皮疹、近關節結節及皮膚、黏膜、骨骼樹膠腫等，心臟血管系統受累，以梅毒性腦膜炎、脊髓癆和麻痹性癡呆多見[11]。隱性梅毒有感染史，可有一期、二期或三期梅毒病史，但無任何梅毒性的臨床癥狀和體征[12]。

目前梅毒的臨床確診，主要依靠實驗室診斷作為依據，常用的實驗室診斷方法有：病原體檢驗（暗視野顯微鏡檢驗DFM、梅毒螺旋體制動試驗TPIT）；血清學檢測-非密螺旋體抗原試驗（快速血漿/血清反應素環狀卡片試驗RPR、甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗TRUST）；血清學檢測-密螺旋體抗原試驗（梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗FTA-ABS、梅毒螺旋體-明膠凝集試驗TPPA、梅毒螺旋體-酶聯免疫吸附試驗TP-ELISA、梅毒螺旋體-化學發光免疫分析CLIA）；基因檢測（PCR技術、二聚體蝎型探針定量技術DSP）[13]。

常用的梅毒螺旋體-明膠凝集試驗TPPA、梅毒螺旋體-酶聯免疫吸附試驗TP-ELISA法因其特異性低，臨床上經常出現假陽性或漏檢的現象[14]，因此探索一種新型，快速，受干擾少的檢測方法十分有必要。時間分辨熒光免疫法TRFIA是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度，目前已經在臨床中廣泛用作多種病毒的實驗室檢測手段[15]。

本研究選取符合標準的患者，通過比較TRFIA、TPPA、TP-ELISA三種方法對不同時期的梅毒檢測的陽性率，發現在無論是一期、二期、三期梅毒、還是隱性梅毒，TRFIA的陽性檢測率均為最高，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步分析其靈敏度、特異性、陽性和陰性預測值、陽性和陰性似然比，發現TRFIA的靈敏度最強，差異有統計學意義（P＜0.01），特異性雖無統計學意義，但結合似然比，當陽性似然比＞10或陰性似然比＜0.1時，診斷或排除某種疾病的可能性將顯著增加，由此可知，TRFIA法的臨床應用價值最高。

此外，通過對三種檢測方法的經濟評價，發現TRFIA法的復測率最低，相應花費較低，TPPA和TP-ELISA由于假陰性率高導致復檢次數增加，給患者帶來經濟負擔的同時，也對疾病的及時確診和治療造成了延誤。

綜上，可以判定時間分辨熒光免疫法TRFIA用于梅毒的實驗室檢測，具有靈敏度強，抗干擾度高的優勢，在很大程度上能夠降低假陽性和漏檢的事件發生。