傳染性造血器官壞死病毒環介導等溫擴增檢測方法的建立和初步應用

何亞鵬，陳怡靜，時 曉，張寶莉，溫戰華，陳春山，李 博，杜迎春

(1.北京市水生野生動植物救護中心，北京 102100；2.鄭州外國語新楓楊學校，鄭州450000)

傳染性造血器官壞死病(infectious haematopoietic necrosis，IHN)是極易對冷水魚養殖造成嚴重危害的魚類急性全身性傳染病，是世界動物衛生組織(OIE)規定必須申報的動物疫病，我國農業部也將其列為二類動物疫病，是第1類魚類口岸檢疫疫病[1]。目前，該病在法國、意大利、德國、英國、日本、韓國、俄羅斯和中國等國家暴發，已形成全球分布；在我國，自1985年東北地區首次報道IHN以來，該病在北京、河北、遼寧、吉林、山東、甘肅、青海、四川、新疆、云南等省、市、自治區均有分布，并有向周圍蔓延的趨勢[2-4]。IHN的病原為彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)，其病毒形態為子彈狀，有囊膜包被[4]。IHNV主要危害鮭鱒魚類的魚苗及幼魚，魚苗死亡率極高，可達100%[1，3]。

IHN可通過臨床和病理診斷進行初步判斷，確診則需要進一步的實驗室檢測。目前檢測IHNV的方法主要病毒分離培養、抗體中和試驗、免疫組化法、ELISA以及RT-PCR等方法。這些方法一般費時費力，且對試驗平臺要求很高，需要一些專業的設備[5-7]。逆轉錄環介導的等溫擴增技術(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)節省實驗步驟，具有操作簡便、快速、特異性強等優點，不需很專業的儀器設備，在水浴鍋中即可完成擴增，特別適用于基層及現場快速診斷[8]。本研究針對IHNV的保守序列核蛋白基因N的特定區域設設計3對特異性引物，并在反轉錄酶和Bst DNA聚合酶的作用下對靶序列進行等溫核酸擴增反應，建立了簡單、快速、靈敏度高、特異性好的IHNV檢測方法，豐富了實驗室和現場檢測IHNV的手段，對IHN快速診斷及防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒RNA提取試劑盒StarSpin Viral RNA Kit購于北京康潤誠業生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker、2×Es Taq MasterMix購于北京康為世紀生物科技有限公司；10×ThermoPol反應緩沖液、Bst 2.0 DNA聚合酶和AMV反轉錄酶購自NEB公司；IHNV BJSY株(Genbank登錄號：MH374162)由本實驗室分離保存，鯉春病毒血癥病毒(spring viraemia of carpvirus，SVCV)、牙鲆彈狀病毒(hirame rhabdovirus virus，HRV)滅活病毒液購自ATCC，病毒性出血性敗血癥病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)滅活病毒購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 RT-LAMP引物設計與合成

對GenBank 收錄的IHNV N基因的多條基因序列進行比對，選取特異性保守區段，利用在線軟件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)針對N基因保守區設計3對RT-LAMP專用引物，序列見表1，引物由華大基因公司合成。將引物均稀釋為20 pmol/μL，-20 ℃保存備用。

表1 N基因RT-LAMP引物序列

1.3 病毒RNA的提取

取200 μL病毒液于無RNA酶的離心管中，用StarSpin病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA，分裝，使用A one超微量全光譜分光光度計(北京同立創輝儀器有限公司)，測定提取到的病毒樣品的RNA濃度，用DEPC處理水稀釋RNA樣品為10 μg/μL，置于-80 ℃備用。

1.4 RT-LAMP檢測方法的建立及優化

建立25 μL的RT-LAMP擴增反應體系。體系包含對應于N基因的6 條引物：F3-N與B3-N各0.5 μL；FIP-N與BIP-N各2 μL；LF-N與LB-N各1 μL、dNTP(10 nmol/L) 2.5 μL，10×ThermoPol 反應緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L(NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100] 2.5 μL，8 U Bst 2.0 DNA 聚合酶，10 U AMV 反轉錄酶，1 μL IHNV的RNA樣品(10 μg/μL)，無RNA 酶水補齊至25 μL，混勻，同樣的體系設立5個樣品，編號1～5。將5個樣品分別在61、62、63、64、65 ℃恒溫水浴鍋反應35 min，隨后都轉移至80 ℃水浴2 min用以滅活Bst DNA聚合酶。反應結束后，擴增產物各加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應液顏色變化判斷結果。取5 μL產物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，確定最佳反應溫度。

1.5 RT-LAMP特異性實驗

分別取IHNV、SVCV、HRV 和VHSV基因組RNA(10 μg/μL)各1 μL為模板，分別構建RT-LAMP體系，利用建立的RT-LAMP檢測方法，進行特異性對比實驗，同時以去離子水為模板，相同體系和條件反應作為陰性對照。擴增結束后產物加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應液顏色變化，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對比檢測結果。

1.6 RT-LAMP靈敏性實驗

將提取的IHNV的RNA(10 μg/μL)10倍梯度稀釋成濃度為1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5μg/μL的病毒RNA,各取1 μL分別構建RT-LAMP體系，采用優化過的條件進行檢測，進行靈敏性試驗。擴增產物加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應液顏色變化，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對比檢測結果，得出該方法能檢測出的IHNV的核酸的最低濃度。

1.7 重復性試驗

利用建立的RT-LAMP 檢測方法，在不同時間，對同一陽性IHNV的RNA樣品進行檢測，以驗證本方法的穩定性。

1.8 RT-LAMP的臨床檢測

從河北省多個虹鱒魚養殖場采集疑似患IHN的幼魚，挑選9條分別采集肝組織，用StarSpin病毒RNA提取試劑盒提取RNA，編號1～10，分別取1 μL的1～10號RNA樣品利用本試驗建立的IHNV的RT-LAMP進行檢測，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證檢測結果；同時該1～10號RNA樣品利用之前已經建立的IHNV的RT-PCR方法進行檢測[9]，先用反轉錄試劑盒將提取的RNA進行反轉錄，然后以反轉錄產物為為模板，上游引物為5′-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3′，下游引物為5′-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3′，目的片段為825 bp，PCR 程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，25個循環；72 ℃再延伸5 min，然后將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。觀察結果，對比分析該方法在臨床檢測上的適用性。

2 結果與分析

2.1 RT-LAMP反應溫度的優化

將5組25 μL反應體系分別在61、62、63、64、65 ℃恒溫水浴鍋反應35 min，隨后轉移至80 ℃水浴2 min，加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，混勻，觀察顏色變化。結果顯示，當擴增溫度為61、62 ℃時擴增產物加入SYBR Green I后仍為SYBR Green I的原始顏色紅棕色(圖1a)，電泳沒有出現階梯狀電泳條帶(圖1b)；在63、64 和65 ℃時擴增產物加入SYBR Green I后變為熒光綠色(圖1a)，電泳出現階梯狀電泳條帶(圖1b)。該顯色結果與凝膠電泳結果相符，進行3次重復試驗，結果一致，表明該方法在溫度為63、64 和65 ℃可以有效擴增。本試驗采用64 ℃為該方法最佳擴增溫度。

圖1 RT-LAMP反應條件優化結果

2.2 RT-LAMP特異性實驗

IHNV、SVCV、HRV和VHSV同屬水生動物彈狀病毒，病毒基因組結構相似，IHNV和VHSV均可感染鮭鱒魚類，RT-LAMP方法也容易受到相似核酸模板和一些污染物的干擾，出現假陽性擴增[8-9]。因此本試驗利用SVCV、HRV、VHSV和ddH2O作對照檢測該RT-LAMP檢測方法的特異性。結果顯示，以IHNV的RNA為模板，進行RT-LAMP擴增后，產物加入SYBR Green I混勻變為熒光綠色(圖2a)，凝膠結果呈特異性階梯狀條帶(圖2b)；以SVCV、HRV、VHSV和ddH2O為模板相同體系和條件進行RT-LAMP檢測，產物呈紅棕色(圖2a)，凝膠電泳無特異性階梯狀條帶出現，結果為陰性(圖2b)。進行3次重復試驗，結果一致，說明本試驗建立的RT-LAMP檢測方法具有良好的特異性。

圖2 RT-LAMP特異性檢測結果

2.3 RT-LAMP靈敏性實驗

分別以1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5μg/μL的IHNV的RNA為模板，利用建立的RT-LAMP檢測方法，分析該檢測方法的靈敏性。擴增產物加入SYBR Green I后觀察顏色變化，取5 μL經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察驗證可視化檢測結果。結果顯示，當病毒RNA濃度為1.0～1.0×10-4μg/μL時，取1 μL為模板，進行RT-LAMP反應，產物在加入SYBR Green I 后變成熒光綠色(圖3a)，電泳特異性階梯狀條帶(圖3b)，當1.0×10-5μg/μL，產物加入SYBR Green I ，顏色不變，仍為紅棕色(圖3a)，電泳未出現特異性階梯狀條帶(圖3b)，進行3次重復試驗，結果一致，說明本試驗建立的RT-LAMP檢測方法具有較高的靈敏度，可以檢測濃度不低于1.0×10-4μg/μL的IHNV的RNA。

圖3 RT-LAMP靈敏性試驗檢測結果

2.4 重復性試驗

經過3次重復性試驗，結果均一致，證明本試驗所建立的RT-LAMP檢測方法具有良好的重復性和穩定性。

2.5 RT-LAMP臨床應用檢測結果

臨床上采集的10個樣品提取的的RNA樣品利用本試驗建立的IHNV的RT-LAMP進行檢測，同時利用之前已建立的IHNV的RT-PCR檢測方法作為對比試驗，結果表明，4號、9號樣品呈現熒光綠色，樣品中檢出IHNV，其余8個樣品檢測結果呈紅棕色(圖4a)，未檢測出IHNV，瓊脂糖凝膠電泳結果也表明4號、9號樣品出現電泳特異性階梯狀條帶(圖4b)，為IHNV陽性，其余8個樣品為陰性。該實驗結果與之前已建立的檢測IHNV的RT-PCR方法的結果一致，4號、9號樣品出現825 bp的條帶(圖4c)，證明了該RT-LAMP方法可在臨床上進行應用。

圖4 臨床樣品檢測結果

3 討論

我國近幾年冷水魚養殖發展迅速、前景廣闊，但IHN在我國多地的冷水魚養殖場持續爆發，由我國東北、東部、中部各省市向西北、西南各省蔓延，對冷水魚養殖業造成嚴重威脅[1,3]。為保障我國冷水魚養殖業的健康發展，需要警惕IHN的爆發，采用先進方法快速確定病原，及時做好防控。LAMP技術由于其簡單易于操作，結果可靠，所以逐步被廣泛應用于病原體檢測，國內外已建立多種檢測病毒的LAMP方法[10,11]。該方法利用特異性識別靶序列的3對引物及一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，可以在恒溫條件進行核酸的指數級擴增，克服了PCR方法需要通過反復的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，避免了對PCR儀的依賴，節省了反復升降溫的時間[8]。本試驗針對IHNV的保守序列核蛋白基因N的特定區域設計3對特異性引物，建立IHNV的反轉錄LAMP檢測方法，優化反應溫度，選取64 ℃為該方法最佳擴增溫度；在特異性實驗檢測中，利用IHNV與3種同屬水生動物彈狀病毒(SVCV、HRV、VHSV)提取的核酸進行特異性實驗，IHNV能在短時間內檢測出來，而同屬水生動物彈狀病毒均無擴增；靈敏度試驗結果表明本RT-LAMP檢測方法最低可檢出1.0×10-4μg/μL的IHNV核酸，與RT-PCR檢測方法的靈敏度相當；臨床上檢測效果很好，適合推廣應用。

RT-LAMP方法可以利用熒光染料直接染色，并通過染料顏色的變化或者凝膠電泳方法判定結果。有研究利用濁度分析儀檢測LAMP的焦磷酸鹽沉淀來判定檢測結果，但在實際中使用該方法的檢測靈敏度較差，不如熒光染料法和電泳法[12]。因此本試驗采用熒光染料法和電泳法結合進行結果分析，更能直觀地觀察到待測樣品的檢測結果，相互驗證。LAMP方法簡單快捷，具有很多優點，適用于基層及現場快速診斷，但由于LAMP方法的擴增非常高效，容易使空氣中很容易形成核酸片段的氣溶膠污染，在封閉環境長期檢測同類樣品時容易出現假陽性，因此需要特別注意，防止管內的核酸片段擴散到封閉環境的空氣中[12]。所以如果需要封閉環境長期檢測同類樣品，可以在進行反應之前將稀釋的SYBR Green I小心加到裝有樣品的PCR管蓋上，待反應結束后，不開蓋，直接離心，SYBR Green I落入管底，漩渦震蕩混勻即可觀察顏色變化，這樣可防止開蓋引起的氣溶膠污染，避免假陽性的出現。

綜上所述，本研究建立的檢測IHNV的RT-LAMP檢測方法，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優點，不需很專業的儀器設備，在水浴鍋中即可完成擴增，適用于基層及現場快速診斷，豐富了實驗室和現場檢測IHNV的手段，對鮭鱒魚苗的引種、無特定病原體種魚的培育、鮭鱒無公害健康養殖，以及IHN的快速檢測及防控均有重要意義。