豬小腸微血管內皮細胞的分離培養與純化

施曉杰,馬維超,鄧昱晨,鄧 偉,張 倩,馮 波,穆祥

[1.北京農學院動物科技學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室,北京 昌平 102206；2.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193]

血管內皮細胞可調節機體內環境穩定,具有分泌、合成、代謝及免疫功能,可產生多種細胞因子和生物活性物質[1]。不同于大血管內皮細胞,在不同組織器官之間,微血管內皮細胞在表型和功能上均表現出差異性[2]。腸微血管內皮細胞襯附于腸絨毛血管內壁,呈網囊狀,是血管內外物質交換的重要屏障和各種腸內毒素入血的必經通路。目前關于豬腦微血管內皮細胞的分離培養方法已有諸多報道,但是尚未有成熟的豬小腸微血管內皮細胞(PIMVECs)分離方法的相關研究。因此本試驗嘗試采用酶消化法和免疫磁珠分選法,建立一套成熟的分離PIMVECs的方法。

1 材料

1.1 實驗動物 英系長白SPF新生仔豬,購自北京市SPF豬育種管理中心,實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2018—0007。

1.2 主要儀器和試劑 CO2培養箱(SANYO公司,MCO17AC)；多功能酶標儀(BIOTEK公司,SYNERGY4)；熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,IX71A21PH)；磁珠分選儀(Thermo公司,710)；澳洲胎牛血清(Gibco公司,1099141)；DMEM高糖培養基(Gibco公司,1930009)；青鏈霉素(Gibco,15140122)；胰蛋白酶(Sigma公司,03126)；I型膠原酶(Gibco公司,17100-017)；DAPI染色液(Bioss公司,C-0033)；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司,C0035)；抗小鼠IgG磁珠(In-vitrogen公司,11531D)；小鼠抗豬CD31(Novusbio公司,10065336)；FITC標記羊抗兔IgG(Abbine公司,A23220)；兔抗人Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體(CUSABIO公司,P00451)。

2 方法

2.1 細胞的分離 取新生SPF長白仔豬,麻醉后用75%酒精全身消毒,在超凈臺中無菌取出空腸段,將其置于含有10%青鏈霉素的冷D-Hank′s浸泡10 min,剔除漿膜層和肌層。將腸段剖開截成3 cm小段,用D-Hank′s清洗數次,直至洗液澄清。刮取腸絨毛,收集于15 mL離心管,加入D-Hank′s,1 200 r/min離心5 min,棄上清及粘液層。將沉淀移入50 mL離心管,按1∶1∶3的比例添加胰蛋白酶、I型膠原酶、DMEM。以上試驗步驟均在冰板上操作。將離心管置于旋轉搖床室溫消化,期間每隔一段時間在顯微鏡下觀察組織消化狀態,防止消化過度。消化完全后加入等量含20%FBS的DMEM完全培養基終止消化。消化液過100、200目細胞篩網,1 200 r/min離心收集細胞。取部分細胞直接接種于六孔板,待細胞長滿后純化。

2.2 細胞的純化 取25 μL磁珠,用Buffer 1(含0.1%BSA 的 PBS)吹洗3 次,加入20 μL(1∶100)小鼠抗豬CD31抗體后混勻,4℃孵育過夜。將過夜后的磁珠移入深孔板,在磁珠分選儀上用Buffer 1清洗3次,收集磁珠于EP管中。用Buffer 2(0.1%BSA和2 Mm EDTA的PBS)重懸細胞,稀釋為1×107個/mL的細胞懸液,加入磁珠混勻,4℃ 孵育20 min,每隔5 min震蕩。將細胞移入深孔板,用Buffer 1在磁珠分選儀上連續分選3次,將分選后的細胞收集到含Buffer 3(0.1%BSA、1 mmol/L CaCl2和 5 mmol/L MgCl2的PBS)的EP管中,加入Releasing Buffer室溫孵育15 min分離目的細胞和磁珠。將孵育好的混懸液加入深孔板,用磁珠分選儀吸棄磁珠。吸取深孔板內純化后的細胞接種于六孔板,2 h后換液,用差速貼壁的方法進一步優化細胞。此后每2 d換液1次。

2.3 細胞的鑒定 采用免疫熒光法檢測所分離細胞上的Ⅷ因子。將培養的第二代細胞接種于24孔板,待細胞長滿80%時,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛(4℃)固定20 min。PBS洗滌細胞3次,滴加兔抗人Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體(1∶200),4℃過夜孵育。陰性對照組用PBS代替Ⅷ因子?？贵w孵育結束后,PBS洗滌3次,滴加FITC標記羊抗兔IgG(1∶200),室溫避光孵育 1 h,加入 DAPI(1∶300)孵育5 min。孵育結束后,PBS洗滌3次,加入封片劑,于熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 WST-1試劑盒檢測純化后細胞的增殖能力

將純化后的細胞消化后接種96孔板中,細胞密度為1×104個/孔,每個時間點接種6個復孔,同時設空白對照組。37℃、5%CO2培養箱內靜置培養,每隔24 h加入WST-1,繼續培養1 h后用酶標儀測定450 nm波長處OD值,未測定細胞每隔2 d換液。比色時用空白對照孔平均值調零,以培養時間為橫坐標,平均光吸收度為縱坐標,以單點標示出每日細胞吸光度檢測平均值,繪制細胞生長曲線。

2.5 細胞的凍存與復蘇 將第5次傳代后的細胞,按照梯度凍存法凍存[3]。30 d后取出凍存管復蘇細胞,接種于6孔培養板,37℃、5%CO2培養箱中培養,觀察復蘇后細胞的形態及生長情況的變化。

2.6 統計學處理 試驗結果采用Graphpad Prism6軟件進行統計學處理,計量資料均以ˉ±s表示。

3 結果

3.1 細胞的分離 清洗后的腸黏膜表面無黏液,腸絨毛張開(見封底彩版圖1A),刮取腸黏膜層收集腸絨毛(見封底彩版圖1B)。經復合酶消化后腸絨毛斷裂,消化液中出現大量細胞即為消化完全(見封底彩版圖1C)。離心消化液,沉淀過篩后即為未純化的PIMVECs(見封底彩版圖1D)。

圖1 PIMVECs分離

3.2 細胞形態觀察 純化的PIMVECs培養1 d后,倒置顯微鏡下可見貼壁細胞呈短梭形或三角形,形態清晰,大小均勻,反光較強。3 d后培養皿內貼壁細胞分裂增殖,呈單層生長。7 d后貼壁細胞長滿細胞皿,呈現出較為典型的內皮細胞形態,細胞逐漸融合,形成“鋪路石樣”,出現接觸抑制現象,視野中細胞形態勻一,未發現其他細胞形態。

未純化的PIMVECs培養1 d后鏡下可見長、短梭形和多邊形細胞,形態清晰；3 d后細胞鋪滿培養皿,呈單層生長,細胞伸出偽足,呈多邊形,未形成典型“鋪路石樣”；純化時細胞吸附磁珠較少,純化后的細胞數量稀少,死亡較多,貼壁細胞顏色加深,細胞核體積增大。

3.3 PIMVECs的鑒定 免疫熒光法檢測Ⅷ因子相關抗原呈陽性,視野中細胞胞漿呈現綠色熒光(見封底彩版圖2A),DAPI染色后細胞核均呈現藍色熒光(見封底彩版圖2B),陽性細胞數超過95%。對照組中細胞未呈現綠色熒光(見封底彩版圖2D)。

圖2 Ⅷ因子相關抗原免疫熒光鑒定(40×)

3.4 WST-1試劑盒檢測PIMVECs的增殖情況用WST-1試劑盒測定PIMVECs的生長狀況,使用Graphpad Prism6軟件繪制生長曲線,發現3 d達到對數生長期,5 d達到平臺期(圖3)。

圖3 PIMVECs的生長曲線

3.5 凍存對PIMVECs形態及生長的影響 復蘇后的細胞在2 h內完成貼壁,6 h后細胞完全伸展,以梭形和鋪路石狀種狀態存在,形態清晰,說明純化后的細胞具有良好的儲存能力,復蘇后仍具有很強的細胞活性。

4 討論與結論

養豬業是我國養殖業重要組成部分,而豬病在近幾年給我國養豬業帶來了巨大的經濟損失。臨床常見豬病大多伴發腸道反應,比如豬水腫病可引起腸道組織水腫,豬流行性腹瀉的剖檢眼觀變化僅限于小腸病變。通過對引起腸道病變的腸毒素等毒力因子的研究發現,微血管內皮細胞的異常反應可能是引起腸道病變的主要原因[4]。微血管內皮細胞不僅具有物理屏障作用和生物學功能,而且具有組織器官特異性。自1980年P.M.Davison成功分離了內皮細胞(MVECs)[5]以后,不同物種不同器官的MVECs原代培養技術不斷創新改進,其中人和鼠的心臟、肺臟和腸道的微血管內皮細胞培養技術已經相當成熟[6],而豬小腸微血管內細胞的分離培養鮮有報道。由此可見,基于在細胞水平上深入研究豬消化道疾病的發生機制,建造病理模型,PIMVECs的分離純化培養顯得尤為重要。

目前,國際上存在的微血管內皮細胞分離培養方法多為植塊法和酶消化法,不同部位的微血管內皮細胞培養要求也不一致。相比用植塊法培養肺微血管內皮細胞,腸絨毛容易夾帶菌體且富含外泌細胞,組織塊貼壁不牢,因此細胞爬出較慢,并且爬出細胞中成纖維細胞及其他雜細胞較多,后期傳代過程中不易去除,難以維持目的細胞后期的優勢生長,所以腸組織不宜使用植塊法。酶消化法雖然較植塊法復雜,而且消化時間和酶濃度難以把握,但可在短時間內獲得大量細胞,因此適合于持續免疫磁珠純化試驗。

據報道,動物在剛出生時,其胃腸道中是無菌的,但出生后的4 h左右,微生物就能在消化道內定植和繁殖[7]。仔豬剛出生時,通過母體產道時獲得了母體的微生物,之后通過生長環境接觸各種微生物,并經過與宿主的相互適應和選擇,逐漸形成復雜的胃腸道內菌群生態系統[8]。因此PIMVECs的原代分離培養純化盡量選取新生仔豬,從而降低細胞污染風險。由于腸黏膜表面的黏液會降低細胞過篩率,并且容易裹挾細菌,純化過程中粘附免疫磁珠,影響磁珠與細胞的結合效率,因此取材腸段要多次清洗至腸絨毛分散,洗液清亮。通過優化消化酶的比例搭配,將消化下來的細胞直接進行免疫磁珠純化,可一次性短時間內獲得大量高純度PIMVECs。多次試驗發現,未純化細胞因雜細胞較多,成纖維細胞較微血管內皮細胞更易生長分裂,細胞長滿時即不能形成“鋪路石樣”?！颁伮肥瘶印笔莾绕ぜ毎袆e于其他細胞的特征性細胞形態,但是在多次傳代培養后的內皮細胞,形態常由“鋪路石樣”轉變為梭形和多角形[9-10]。我們在培養過程中發現,“鋪路石樣”存在于細胞前2代,后期細胞形態根據培養時間、培養基中血清濃度和傳代方式等因素逐漸轉變。因此,細胞形態可作為鑒定微血管內皮細胞的參考指標,主要還是通過免疫細胞化學進行鑒定。

本試驗選擇CD31因子對目的細胞進行捕捉純化。研究表明,內皮細胞表面標記CD31、CD102的高表達僅限于1～3代[11]。本次試驗中,將組織分離的細胞進行傳代增殖培養再純化,因在傳代培養過程中PIMVECs未能形成優勢生長,且PIMVECs表面CD31抗原標志物表達降低,在純化過程中磁珠較難捕捉到目的細胞,故純化出的細胞數量稀少,活性較差,少數貼壁細胞趨于老化生長,增殖能力減弱。相比于前者,直接對組織消化后的單細胞進行陽性分離,減少了原代細胞培養周期和試劑投入,同時保持目的細胞活性和表面標志物的高表達,提升目的細胞與磁珠的結合效率,增加純化細胞的檢出量,后期結合Ⅷ因子相關抗原陽性表達,細胞純度可達95%以上。此方法在磁珠分選過程中對目的細胞進行多次清洗,減少了細菌污染的機率。磁珠純化儀的原理與磁性分離架相同,因此在不具備磁珠純化儀的情況下亦可使用磁力架進行后續的細胞純化。

WST-1是一種類似于MTT的化合物,比MTT更加穩定,線性范圍更寬,靈敏度更高。WST-1在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的一些乳酸脫氫酶還原成橙黃色的甲臜(Formazan)。細胞增殖越多越快,則顏色越深。配合酶標儀測定的吸光度值可直觀準確的反應活細胞量。

綜上所述,本研究成功建立了一種快速高效分離豬小腸微血管內皮細胞的方法。通過此方法獲得的豬腸微血管內皮細胞生長快,數量多,周期短。