溫度、添加濃度和微生物對噻蟲胺在稻田土壤中降解的影響

張怡寧，殷 麗

(1．上海市崇明區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，上海 200085；2．上海市浦東新區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，上海 202150)

1 試驗材料

1.1 試驗地概況與作物品種

試驗在上海市崇明區(qū)東平鎮(zhèn)農(nóng)田展開。崇明區(qū)東平鎮(zhèn)隸屬于上海市，位于長江入海口，全區(qū)地勢平坦，屬典型海洋性氣候，年平均氣溫16.8 ℃，年平均降雨量1025 mL，土壤肥力中等偏上，地勢平整，灌溉條件良好，該農(nóng)田的水肥管理和其他栽培條件基本一致。試驗地水稻品種為銀香18。

1.2 試驗藥劑

(1)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。99.9%噻蟲胺原藥 clothianidin，上海凱試科技有限公司，

(2)農(nóng)藥制劑。20% 噻蟲胺SC(30-50 mL/667 m2)， 河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司

1.3 試劑與儀器

1.3.1 供試試劑

實驗過程中所使用的試劑目錄見表1。

表1 試劑目錄

1.3.2 供試儀器

Waters 600E高效液相色譜儀(美國 Waters)；色譜柱Diamonsil-C18，(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Waters 2487紫外檢測器；島津GC2010氣相色譜儀(日本島津)，石英毛細(xì)管柱hp-5，30 m×0.32 i.d.mm×0.25 μm，帶FID檢測器；AL104分析天平(瑞士梅特勒公司)；DFT-250手提式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；JLGJ4.5檢驗礱谷機(浙江臺州市糧儀廠)；SHZ-82恒溫振蕩器(常州澳華儀器有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)； HS10260D超聲波清洗機(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；玻璃層析柱(長30 cm、直徑1.2 cm)；量筒；移液管；滴管；容量瓶；三角瓶；抽濾瓶；布氏漏斗；分液漏斗；玻璃棒等常用實驗儀器。

2 試驗方法

2.1 土壤樣品采集

采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1126.1-2006：土壤樣品的采集、處理和貯存。

2.2 試驗設(shè)計

2.2.1 溫度對農(nóng)藥降解的影響

稱取100 g空白植稻土壤(精確到0.01 g)放入250 mL錐形瓶中，按推薦劑量加入農(nóng)藥，然后加入無菌蒸餾水將土壤淹沒，并保持2～3 cm的水層，混勻后將所有土樣分別放入15 ℃ 、20 ℃ 、25 ℃ 、30 ℃ 和35 ℃ 恒溫(± 0.5 ℃)培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。

2.2.2 添加濃度對農(nóng)藥降解的影響

稱取100 g空白植稻土壤(精確到0.01 g)放入250 mL錐形瓶中，按推薦劑量的0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍和2.5倍加入農(nóng)藥，然后加入無菌蒸餾水將土壤淹沒，并保持2～3 cm的水層，混勻后將所有土樣放入25 ℃恒溫(± 0.5 ℃)培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。

2.2.3 土壤微生物對農(nóng)藥降解的影響

稱取兩組空白植稻土壤各100 g(精確到0.01 g)，放入250 mL錐形瓶中，其中一組用高壓濕熱法滅菌2次(每次60 min，120 ℃)，然后兩組均按推薦劑量加入農(nóng)藥，再加入無菌蒸餾水將土壤淹沒，并保持2～3 cm的水層，混勻后將所有土樣放入25 ℃恒溫(± 0.5 ℃)培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。

以上每個處理均重復(fù)3次，培養(yǎng)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d和28 d分別取樣測定農(nóng)藥的殘留量。另外每3 d觀察一次各處理的水層位置，水少的加水補充，以保持水層位置不變。

農(nóng)藥推薦劑量：噻蟲胺為120 mg/kg。

2.3 土壤樣品中噻蟲胺的提取

稱取10.0 g土樣，放入250 mL三角瓶中，加入100 mL丙酮，于25 ℃下恒溫振蕩0.5 h，高速離心分離，將上清液過濾至三角瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(水浴溫度30 ℃)蒸干丙酮，將剩余溶液倒入250 mL分液漏斗中，加入30 mL乙酸乙酯，振蕩萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(水浴溫度30 ℃)濃縮至近干，氮氣吹干，用甲醇定容至5 mL，過0.45 μm有機濾膜，待高效液相色譜測定。

2.4 檢測條件

色譜柱：Diamonsil-C18，(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器：Waters 2487紫外檢測器；流動相：甲醇∶水=3∶7(V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：266 nm；進(jìn)樣量：5 μL；保留時間：21.4 min；外標(biāo)峰面積法定量。

2.5 檢測分析方法驗證

2.5.1 色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.1000 g(精確至0.0002 g)噻蟲胺農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇有機溶劑定容至100 mL，即配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品母液，然后用甲醇稀釋成一定梯度的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液，在相應(yīng)的色譜條件下檢測。檢測完成后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，檢測到的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)。

2.5.2 最低檢出量

標(biāo)樣配制與工作曲線最低檢出濃度，即方法的靈敏度在實驗色譜條件下，以產(chǎn)生3倍噪聲時的最小進(jìn)樣量計算。

最低檢出濃度(%)=

2.5.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在10.0 g空白土壤樣品中分別添加0.1、0.5、1.0 mg/kg的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度3個重復(fù)，按各自方法對樣品進(jìn)行提取、凈化、檢測。方法的準(zhǔn)確度以全過程標(biāo)準(zhǔn)添加回收率來衡量，方法的精密度以測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來衡量。

添加回收率(%)=

2.6 殘留量計算

根據(jù)所測峰面積，采用外標(biāo)峰面積法計算樣本中的農(nóng)藥殘留量Ax。

計算公式如下：

式中：C為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)；S1為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；S2為樣本峰面積；V為定容體積(mL)；V1為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣體積(μL)；V2為樣本進(jìn)樣體積(μL)；G為樣本量(g)。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和檢出限

用色譜純甲醇把噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)母液1000 mg/kg稀釋成0.05、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L等5個濃度。在上述色譜條件下，進(jìn)樣5 μL，色譜圖見圖1。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到噻蟲胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，其直線回歸方程為：y=14008x+14249，相關(guān)系數(shù)為0.9919，保留時間約為21.4 min，噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品在0.05～10.00 mg/kg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。按上述儀器條件的3倍噪音計算噻蟲胺有效成分的最低檢出濃度：土壤為0.003 mg/kg、稻稈為0.004 mg/kg、谷殼為0.006 mg/kg、糙米為0.009 mg/kg，最低檢出量為1.5×10-11g。因此，在后續(xù)工作中采用此檢測方法進(jìn)行樣品分析。

圖1 噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖2 噻蟲胺線性關(guān)系

3.2 檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度

噻蟲胺在土壤中的平均添加回收率為90.3%～96.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%～3.44%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.13%～3.81%(表2)；基本符合農(nóng)藥殘留分析的技術(shù)要求(樊德方，1982)。

3.3 溫度對噻蟲胺降解的影響

在不同溫度條件下，噻蟲胺的殘留量隨時間的變化趨勢均符合一級動力學(xué)方程(表3)，當(dāng)溫度由15 ℃升至30 ℃時，噻蟲胺的半衰期從20.17 d縮短至9.73 d，但當(dāng)溫度由30 ℃升至35 ℃時，其半衰期9.73 d升至10.89 d。這可能是由于溫度的升高使土壤中有機物粘度降低，提高了生物利用率，但更主要的原因可能是：隨著外界環(huán)境溫度逐漸接近于降解噻蟲胺的微生物的最適溫度(30 ℃左右)，微生物體內(nèi)各種酶的活性不斷增強，加快了微生物的代謝活動，從而加速了噻蟲胺的降解。

表2 噻蟲胺在土壤中的添加回收率結(jié)果

表3 噻蟲胺在不同溫度土壤中降解的動力學(xué)參數(shù)

3.4 添加濃度對噻蟲胺降解的影響

0.1～2.0倍推薦劑量的噻蟲胺在土壤中的的殘留量隨時間的變化趨勢均符合一級動力學(xué)方程(表4)，隨著添加濃度的升高，噻蟲胺的降解速率常數(shù)由0.1435下降至0.0407，這可能是由于噻蟲胺添加濃度的增大抑制了土壤中降解噻蟲胺的微生物的酶活性，使微生物的代謝活動減弱，延緩了噻蟲胺的消解。顯著性檢驗結(jié)果表明，不同添加濃度的噻蟲胺的降解速率均存在顯著差異。

表4 不同添加濃度噻蟲胺在土壤中降解的動力學(xué)參數(shù)

3.5 土壤微生物對噻蟲胺降解的影響

噻蟲胺在滅菌和未滅菌的土壤中的的殘留量隨時間的變化趨勢均符合一級動力學(xué)方程(表5)。噻蟲胺在未滅菌土壤中的降解速率比其在滅菌土壤中提高了3.28倍，半衰期由未滅菌條件下的10.78 d增加至滅菌條件下的35.37 d，說明微生物對噻蟲胺在土壤中的降解具有明顯影響，微生物可加速其降解，而水解和化學(xué)降解等非生物降解作用所產(chǎn)生的影響相對較小，噻蟲胺在土壤中的降解速率主要由微生物決定。

表5 噻蟲胺在滅菌與未滅菌土壤中降解的動力學(xué)參數(shù)

4 結(jié)論與討論

本文在實驗室模擬條件下對不同溫度、添加濃度和土壤微生物對噻蟲胺降解的影響進(jìn)行了研究。土壤微生物對農(nóng)藥的降解起主要作用，環(huán)境的溫度和農(nóng)藥的添加濃度等因素對農(nóng)藥的降解也有一定的影響。得出了以下主要結(jié)論。

(1)在15～30 ℃條件下，隨著土壤溫度的升高，噻蟲胺在土壤中的降解速率呈升高趨勢，可能的原因是：隨著環(huán)境溫度逐漸接近于降解農(nóng)藥的微生物的最適溫度，微生物體內(nèi)各種酶的活性不斷增強，加快了微生物的代謝活動，從而加速了農(nóng)藥的降解；當(dāng)土壤溫度由30 ℃升至35 ℃時，噻蟲胺的降解速率開始下降，這可能是因為當(dāng)溫度過高時，土壤微生物體內(nèi)的酶活性受到抑制，使噻蟲胺的降解速率下降。

(2)隨著土壤中噻蟲胺的添加濃度從0.1倍增加到2.0倍，其在土壤中的降解速率均逐漸下降。

(3)滅菌土壤的試驗結(jié)果反映了非生物消解作用(包括水解、化學(xué)降解等)對農(nóng)藥降解的影響，而未滅菌土壤的試驗結(jié)果反映了非生物消解和土壤微生物消解的共同作用。本試驗中的噻蟲胺在滅菌土壤中的降解半衰期均遠(yuǎn)大于在未滅菌土壤中的降解半衰期，說明土壤微生物對農(nóng)藥降解起主要作用。

綜上所述，當(dāng)溫度在30～35 ℃，農(nóng)藥濃度適宜時，土壤微生物的活性最強，土壤中的噻蟲胺降解最快。