具有α-淀粉酶抑制活性基團的新型抗性淀粉的制備及其體外降糖活性研究

宋彥顯，閔玉濤*，馬慶一

1(鄭州工程技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450044) 2(鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南 鄭州，450002)

糖尿病是危害人類健康的最重要的非傳染性疾病之一[1]。2017年，國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的報告顯示，全球糖尿病患者達4.25億，中國是糖尿病患者最多的國家達到1.14億，預(yù)計2035年糖尿病患者將達到5.92億[2]。糖尿病發(fā)病率逐年上升，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一[3-5]。目前用于治療糖尿病的藥物大多是合成藥物，這些藥物的使用會誘發(fā)一些副作用[6-7]，不能滿足人們對健康的渴求，因此必須找到新一類有效的副作用較小的化合物。

控制糖尿病就必須控制血糖[8]，但糖尿病患者由于代謝紊亂，葡萄糖不能被機體正常吸收[9]，導(dǎo)致餐后血糖的上升。α-淀粉酶抑制劑可以通過抑制α-淀粉酶的活性，抑制淀粉的分解，將葡萄糖的吸收速率降低，從而抑制了餐后血糖升高。馬艷麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著大米粥中白蕓豆α-淀粉酶抑制劑添加量的增加，大米粥的淀粉水解率不斷下降。因此α-淀粉酶抑制劑可作為平衡血液中的葡萄糖濃度和限制餐后高血糖一種新的有效藥物[11-13]，且淀粉酶抑制劑不會產(chǎn)生有害的副作用[14-15]。

抗性淀粉較其他淀粉難降解[16]，從而在體內(nèi)緩慢釋放葡萄糖，具有較低的胰島素反應(yīng)，可控制餐后血糖平衡并可以讓糖尿病患者減少饑餓感，特別適宜糖尿病人群食用。抗性淀粉對降糖有一定的作用，有研究顯示[17-18]，攝入高抗性淀粉可以有效改善糖尿病患者的胰島素抵抗。另有研究表明[19-24]，抗性淀粉可使餐后葡萄糖濃度顯著降低。

淀粉有大量的羥基，如以結(jié)構(gòu)簡單α-淀粉酶抑制因子對交聯(lián)淀粉加以修飾，將得到具有抑制α-淀粉酶活性基團的變性淀粉，其降糖效果在變性及抑制α-淀粉酶活性的雙重作用下將會成倍提高。這樣既可讓糖尿病患者享受“飽餐”的幸福，又不用擔(dān)心餐后血糖的升高，從而達到藥食同源的目的。但目前尚未見這方面的研究報道。

閔玉濤等[25]以土豆淀粉為原料，環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，制得了一種具有降糖活性的抗性淀粉(環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)淀粉)，其消化性能比原淀粉降低了34.5%。宋彥顯等[26]發(fā)現(xiàn)，五倍子中有結(jié)構(gòu)相對簡單的α-淀粉酶抑制因子——月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸。本文以上述抑制因子作為活性基團，修飾環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)淀粉的羥基，制備新型抗性淀粉，以得到具有雙重降糖活性的功能性淀粉，為糖尿病病人開發(fā)出新型高效的降糖食品基料，開拓抗性淀粉在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰臟α-淀粉酶，自制，比活力 856 U/mg；土豆淀粉，購于鄭州市種子批發(fā)市場；十二酸，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；十四酸，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；十六酸，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。氯化亞砜，化學(xué)純，西隴化學(xué)試劑廠；苯，分析純，上海華彭實業(yè)有限公司；吡啶，分析純，上海華彭實業(yè)有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiscan MK3酶標(biāo)儀，芬蘭；723可見分光光度計,上海第三分析儀器廠；HH-S11-2電熱恒溫水浴鍋,北京長安科學(xué)儀器廠；TGL-18C高速冷凍離心機，上海安亨科學(xué)儀器廠；TLJ-2定時增力電動攪拌，江蘇省姜堰市天力醫(yī)療器械廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；Nicolet170SXFT-IR傅立葉紅外光譜儀，Thermofisher。

1.3 實驗方法

1.3.1 棕櫚酸交聯(lián)淀粉酯的合成

1.3.1.1 棕櫚酰氯的合成方法

在150 mL三頸燒瓶中加入0.1 mol棕櫚酸，水浴加熱至溶解(67 ℃)，攪拌下滴加0.16 mol(11.6 mL)氯化亞砜，30 min滴完，繼續(xù)攪拌4 h。停止反應(yīng)后，減壓蒸餾回收剩余氯化亞砜，得到脂肪酰氯將反應(yīng)液傾入干燥的100 mL滴液漏斗中，混勻，密閉備用。

1.3.1.2 土豆交聯(lián)淀粉的制備

參考閔玉濤等[25]的方法制備土豆交聯(lián)淀粉。稱取50 g土豆淀粉，溶解于75 mL堿性NaCl溶液(3.75 g NaCl和0.75 g NaOH溶于125 mL蒸餾水中配制而成)中，置于50 ℃恒溫水浴鍋中。攪拌5 min后逐滴加入含有環(huán)氧氯丙烷的堿液(堿性NaCl溶液12.5 mL，環(huán)氧氯丙烷1 mL)，攪拌下反應(yīng)6 h。反應(yīng)完畢，用稀HCl調(diào)pH值至7.0，靜置30 min后，離心(1 000×g，10 min，4次)，去上清液，將底部沉積物轉(zhuǎn)移到搪瓷盤中，置于干燥箱中，55 ℃下干燥，研磨，得土豆交聯(lián)淀粉。

1.3.1.3 棕櫚酸交聯(lián)淀粉酯的合成

在裝有攪拌器和回流冷凝水的三口燒瓶中，依次加入一定量的土豆交聯(lián)淀粉和吡啶，攪拌使其充分分散，95 ℃下活化反應(yīng)1 h后，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，滴加棕櫚酸酰氯，30 min滴完，反應(yīng)一定時間，冷卻，將產(chǎn)物加入到無水乙醇中，攪拌，將酯化產(chǎn)物沉析，抽濾，用乙醇及苯洗滌，最后用水多次洗滌，濾餅經(jīng)70 ℃真空干燥24 h，即得粉末狀不溶于水的棕櫚酸交聯(lián)淀粉酯。

1.3.2 月桂酸、豆蔻酸淀粉酯的制備

參照棕櫚酸淀粉酯的制備方法制備月桂酸、豆蔻酸淀粉酯。

1.3.3 產(chǎn)物表征(傅立葉紅外測試)

樣品真空干燥24 h后，用溴化鉀(KBr)混合壓片法，在Nicolet170SXFT-IR型紅外光譜儀上進行測試，連續(xù)60次掃描，儀器分辨率4 cm-1，分析范圍400～4 000 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1。

1.3.4 消化性能研究

按宋彥顯等[27]構(gòu)建的淀粉仿生消化消化法測定新型酯化淀粉的消化性能，取干凈的透析袋，加入1 mL 0.5 %淀粉糊，0.5 mL稀釋好的α-淀粉酶，封口后放入裝有200 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.9)的塑料瓶中(預(yù)先在37 ℃恒溫水浴中保溫)。繼續(xù)37 ℃保溫，不時搖動，每30 min取透析液0.5 mL于1支試管中，共3 h，6支試管分別編號1、2、3、4、5、6，另取1支試管(編號0)，加入0.5 mL緩沖溶液，作為空白對照。向每支試管中分別加入0.6 mL苯酚和4 mL濃硫酸并搖勻，沸水浴加熱30 min，流水冷卻至室溫，于485 nm下測定吸光度值，并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)繪制時間與吸光度值曲線圖。最后對它們的消化性能加以比較，以考察脂肪酸鏈的長短對淀粉的抑制強度及對消化性能的影響。

1.3.5 酯化度的測定

精確稱取淀粉酯0.5 g，放入250 mL碘量瓶中，加入20 mL乙醇，振蕩。加20 mL 0.2 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，蓋緊瓶口，磁力攪拌60 min進行皂化反應(yīng)，加1～2滴1%酚酞指示劑。將已皂化含過量堿的溶液用0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至粉紅消失，同時做空白。

酯化度(每100個葡萄糖單元上連有的酸的個數(shù))的計算如公式(1)所示：

(1)

其中：V1,空白消耗的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL；V2,樣品消耗的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL；c,HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(0.1mol/L)；0.5/170,0.5 g淀粉含有葡萄糖單元物質(zhì)的量,mol。

2 結(jié)果與討論

2.1 棕櫚酸交聯(lián)淀粉酯的合成

2.1.1 酰氯的制備

原料氯化亞砜和產(chǎn)物酰氯均易水解，因此反應(yīng)系統(tǒng)必須干燥無水。用氯化亞砜與制備的酰氯，副產(chǎn)物都是氣體，易于純化。

2.1.2 棕櫚酸交聯(lián)淀粉酯的合成

圖1 環(huán)氧氯丙烷土豆交聯(lián)淀粉的紅外圖譜Fig.1 Infrared spectrum of epoxy chloropropane cross-linked potato starch

圖2 棕櫚酸交聯(lián)淀粉酯紅外圖譜Fig.2 Infrared spectrum of palmitate crosslinked starch ester

2.2 月桂酸及肉豆蔻酸酯化淀粉的制備

圖3 月桂酸交聯(lián)淀粉酯的紅外圖譜Fig.3 Infrared spectrum of lauric acid crosslinked starch ester

圖4 肉豆蔻酸交聯(lián)淀粉酯的紅外圖譜Fig.4 Infrared spectrogram of the crosslinked starch ester of nutmeg acid

2.3 酯化度的測定

經(jīng)測定它們的酯化度分別為：月桂酸淀粉酯2.49、肉豆蔻酸淀粉酯2.43、棕櫚酸淀粉酯2.38。它們的酯化度稍有差別，這可能是3種酸隨碳鏈的增長反應(yīng)活性降低所致。

2.4 三種酯化淀粉消化性能比較

3種酯化淀粉消化性能都比原交聯(lián)淀粉有很大程度的降低(月桂酸淀粉酯80.4%、肉豆蔻酸淀粉酯76.6%、棕櫚酸淀粉酯75.5%)。它們的消化性能差別不大，但仍然可以看出一些規(guī)律，3種酯化淀粉消化性能與3種酸對α-淀粉酶的抑制強度有一定關(guān)系(月桂酸，肉豆蔻酸和棕櫚酸對α-淀粉酶抑制率分別為34.34%、31.71%和31.01%)[26]，抑制率越大，酯化后的淀粉消化性能越差，但這也可能是因為它們酯化度差別的影響，酯化度越高，消化性能越差(圖5)。

圖5 三種交聯(lián)酯化淀粉的消化性能Fig.5 In vitro digestive properties of three cross-linked esterified starch

3 結(jié)論

用α-淀粉酶抑制因子月桂酸和肉豆蔻酸和棕櫚酸對環(huán)氧氯丙烷土豆交聯(lián)淀粉酯化后，得到的具有α-淀粉酶抑制活性基團的新型抗性淀粉，他們的消化性能都比原交聯(lián)淀粉有很大程度地降低(月桂酸淀粉酯80.4%、肉豆蔻酸淀粉酯76.6%、棕櫚酸淀粉酯75.5%)。新型抗性淀粉的消化性能與α-淀粉酶抑制因子對α-淀粉酶的抑制強度及酯化反應(yīng)的酯化度有一定關(guān)系，抑制率越大，酯化度越高，生成的新型抗性淀粉消化性能越差。