產(chǎn)表面活性劑菌與稠油降解菌復配對原油黏度的影響*

王大威，張世侖，靖 波，何春百，張 健，馬 挺

（1.海洋石油高效開發(fā)國家重點實驗室，北京 100027；2.中海油研究總院，北京 100027；3.分子微生物學與技術(shù)教育部重點實驗室，南開大學生命科學學院，天津 300071）

微生物采油技術(shù)已有近一百年的歷史，20世紀20年代美國Beckman 即指出細菌在油藏中的生長有利于石油開采［1］。稠油微生物開采技術(shù)是微生物采油技術(shù)的延伸，也是石油界對稠油開采的一種新的嘗試。微生物稠油降黏機理主要有兩個方面：（1）微生物在地下發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種生物表面活性劑［2］，可分為糖脂類、脂肽類、磷脂類、脂肪酸類、中性油脂類和聚合物類等。表面活性劑不僅能降低油水界面張力和乳化原油，還能通過改變油層巖石界面的潤濕性來改變巖石對原油的相對滲透性，降低稠油的黏度。（2）部分微生物能降低稠油的平均分子量，即微生物能把稠油中的高分子物質(zhì)如蠟質(zhì)、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)分解為低分子量的化合物，降低整個稠油的平均分子量，使稠油黏度降低［3-7］。由于表面活性劑只是改變稠油大分子的空間結(jié)構(gòu)，而未改變其化學組成，稠油會由于色譜分離效應而造成黏度恢復，是為可逆反應，可能造成地層滲流通道及井筒堵塞的問題；與之相比，稠油降解降黏原理是微生物降解原油的大分子組分，減小其平均分子量，由于稠油組份發(fā)生變化，因此為不可逆反應［8］，一方面可明顯改善原油流動性，另一方面可通過降低原油分子量提高原油品質(zhì)。

在微生物降解稠油過程中，原油的疏水性是限制其降解速率的主要因素之一［8-9］。最新的研究結(jié)果表明［9］，某些細菌可以通過產(chǎn)生生物表面活性劑而促使原油乳化并被動擴散進入細胞內(nèi)或細胞外，從而被生物酶捕集降解。目前該技術(shù)已在污染土壤的生物修復中得到廣泛應用。由于稠油是由結(jié)構(gòu)復雜、并難于降解的化合物，如芳烴、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)組成，單一的菌株對其降解較差。利用不同稠油降解菌株作用可將芳環(huán)和雜環(huán)結(jié)構(gòu)破壞后進一步降解，同時產(chǎn)表面活性劑菌株代謝的生物表面活性劑可乳化增溶原油，更加利于降解菌對它的攝取和降解速率。筆者將多種產(chǎn)表面活性劑菌與稠油降解菌復配，通過黏度測定、四組分分析、變性梯度凝膠電泳（Denature Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）等方法研究生物表面活性劑對稠油生物降解的強化作用，分析微生物降解稠油機理，為微生物采油技術(shù)的現(xiàn)場應用提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

渤海N油田A18井原油，黏度（25℃）1146 mPa·s，含瀝青7.79%、膠質(zhì)20.25%；A18 井地層水，礦化度7285 mg/L、離子組成（單位 mg/L）為：Ca2+53.44、Mg2+4.71、K+21.74、Na+628.2、Mn2+0.083、CH3COO-48、NO3-0.1、SO42-3、Cl-120；LB培養(yǎng)基配方（單位g/L）：胰蛋白胨 10、酵母提取物（Yeast extract）5、NaCl 10；發(fā)酵培養(yǎng)基配方（單位g/L）：Na2HPO40.6、KH2PO40.2、NaNO32、FeSO40.02、MgSO40.3、酵母粉 0.5、蔗糖 1，pH 值 7.2；產(chǎn)表面活性劑菌：T-1（Pseudomonas aeruginosa，銅綠假單胞菌屬）、X-3（Bacillus Subtilis，枯草芽孢桿菌），由實驗室分離保存；稠油降解菌：QB26（Bacillus licheniformis，地衣芽孢桿菌）、QB36（Geobacillus pallidus，白色地芽孢桿菌），由實驗室從渤海N油田地層油水樣分離保存；苯、丙酮、甲苯、正庚烷、石油醚，北京百靈威科技有限公司。

Brook field Viscometer LVDV-II+Pro 提桶式旋轉(zhuǎn)黏度計，美國Brookfield 公司；混合纖維素酯濾膜，孔徑0.22 μm，美國默克密理博公司；DNA 純化試劑盒、PCR引物，北京天為時代生物技術(shù)公司；氧化鋁色譜柱，美國賽默飛世爾公司；YLN 22000凝膠影像分析系統(tǒng)，北京亞力恩機電技術(shù)研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法

挑取不同細菌單菌落置于5 mL LB 培養(yǎng)基中，在55℃、120 r/min下震蕩培養(yǎng)過夜，然后取1 mL菌液接種到100 mL LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 作為種子液。取種子液5%分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在55℃、120 r/min下震蕩培養(yǎng)過夜，備用。

1.2.2 黏度的測定

將30 mL產(chǎn)表面活性劑菌、降解菌、或二者復配菌株發(fā)酵液與30 g原油體系混合，55℃搖床培養(yǎng)14 d。在 4號轉(zhuǎn)子、55℃和 400 r/min 的條件下，用旋轉(zhuǎn)黏度計測定油水混合體系的黏度。

1.2.3 原油四組分分析

參照石油天然氣行業(yè)標準SY/T 7550—2012《石油中蠟、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)測定法》進行原油四組分分析。利用氧化鋁吸附色譜法得到的油蠟組分，以苯-丙酮（體積比1∶1）為脫蠟溶劑，經(jīng)冷凍至-20℃結(jié)晶析出的組分即為蠟；預處理后的原油在氧化鋁色譜柱上吸附，用石油醚和苯?jīng)_洗時不能脫附的部分扣除瀝青質(zhì)后的組分即為膠質(zhì)；原油中不溶于正庚烷、溶于甲苯的組分即瀝青質(zhì)。一份試樣經(jīng)蒸餾后用正庚烷加熱溶解沉淀出瀝青質(zhì)，濾出不溶物，并用正庚烷回流除去不溶物中夾雜的油蠟及膠質(zhì)后，用甲苯回流溶解瀝青質(zhì)，除去溶劑，求得瀝青質(zhì)的含量。另一份試樣經(jīng)蒸餾后用石油醚溶解、苯溶劑沖洗，通過氧化鋁色譜柱吸附分離出油蠟部分，再以苯-丙酮混合物為脫蠟溶劑，在-20℃下用冷凍結(jié)晶法脫蠟測定原油中的蠟含量。用差減法計算得到膠質(zhì)含量。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

（1）基因組DNA的提取與純化。培養(yǎng)菌液菌體處理：取1.2.1 節(jié)培養(yǎng)的10 mL 培養(yǎng)液，在高速離心機上以6000 r/min 的速度離心10數(shù)15 min 獲得菌體。具體操作步驟與文獻［10］相同。用DNA 純化試劑盒提取與純化基因組DNA，按照操作說明進行。

（2）16S rDNA 的PCR 擴增。采用可得到更多微生物多樣性信息的V9區(qū)引物進行細菌16S rDNA PCR擴增。因要進行DGGE分析，故此處的引物帶GC 夾子。細菌V9 區(qū)引物的序列為：1406r-GC：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCCC ACG GGC GGT GTG TAC-3'；1055f：5'-ATG GCT GTC GTC AGC T-3'。PCR體系組成為：12.5 μL Premix Taq酶、0.3 μL引物1406r-GC、0.3 μL引物1055f、1 μL模板、二次蒸餾水加至總體積為 25 μL。PCR 程序為：①94℃ 5 min、94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），②94℃45 s、58℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），③94℃ 45 s、56℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），④94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），⑤94℃ 45 s、52℃ 45 s、72℃90 s（×3 cycle），⑥94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 90 s（×15 cycle），⑦72℃ 10 min、4℃ 48 h。

（3）16S rDNA 序列的 DGGE 分析。將純化好的PCR樣品加入制備好的瓊脂糖凝膠（制備方法見文獻［10］）中進行電泳分離，通過YLN22000凝膠影像分析系統(tǒng)觀察每個樣品的電泳圖譜并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)表面活性劑菌對原油界面張力的影響

T-1 菌為銅綠假單胞菌屬，產(chǎn)生的鼠李糖脂（rhamnolipid）分子量較大，具有較強的乳化增溶作用，易形成低黏度乳狀液；X-3 菌為枯草芽孢桿菌，產(chǎn)生的脂肽（lipopeptide）分子量較小，具有較強的降低界面張力的能力。T-1產(chǎn)生的鼠李糖脂、X-3產(chǎn)生的脂肽可分別將原油的界面張力從29 mN/m 降至0.76 mN/m 和0.43 mN/m。盡管鼠李糖脂降低油水界面性能弱于脂肽，但其對原油有較強的乳化作用，因此分別對這兩種表面活性劑開展下一步復配性能研究。

2.2 降解菌和產(chǎn)表面活性劑菌的降黏性能

產(chǎn)表面活性劑菌通過表面活性劑的乳化作用降低原油黏度，而稠油降解菌通過降解稠油中重組分、降低平均分子量進而降低原油黏度。將降解菌和產(chǎn)表面活性劑菌分別單獨與稠油混合，經(jīng)兩種降解菌QB26 和QB36 作用后，原油（作用前黏度為1146 mPa·s）黏度分別降至384 mPa·s 和 478 mPa·s，降黏率分別為64.7%和58.4%；兩種產(chǎn)表面活性劑菌T-1 和X-3 作用后，原油黏度分別降至96 mPa·s和110 mPa·s，降黏率分別為91.6%和90.4%。表面活性劑作用后的原油表觀黏度明顯低于稠油降解菌作用后的值，表明在一般的微生物采油過程中，由乳化產(chǎn)生的降黏作用強于由降解產(chǎn)生的降黏作用。

2.3 降解菌和表面活性劑菌復配后的降黏性能

2.3.1 不同降解菌株復配比

原油是一種由烴、非烴組成的復雜混合物，單一菌種對原油的降解作用具有較強的選擇性和單一性［12］，效果相對受限。因此利用混合菌作用原油可產(chǎn)生較好的共生協(xié)同效應，可降解原油中多種成分，特別對原油中的膠質(zhì)、瀝青質(zhì)等具有芳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，更需要不同菌種復配的協(xié)同作用進行降解。

將QB26和QB36菌液按不同體積比（1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1）混合后加入原油中，測得的原油黏度分別為 453、426、445、407、439、441、435 mPa·s。當菌種復配體系在體積比為1∶1時，原油黏度降至最低。此時兩種降解菌可以產(chǎn)生較好的協(xié)同效應，通過降解不同原油成分，促進互相的菌體生長，形成了互生互養(yǎng)的群落結(jié)構(gòu)。因此確定兩種降解菌種QB26和QB36復配的體積比為1∶1。

2.3.2 不同產(chǎn)表面活性劑菌復配比

通常，單獨使用一種表面活性劑時電性排斥作用較強，疏水鏈的結(jié)構(gòu)多種多樣，在界面上排列不緊密，界面活性不高。若添加分子結(jié)構(gòu)適宜、有協(xié)同作用的輔助表面活性劑，少量即可大大提高油水界面活性，提高驅(qū)油效率，同時又可減少形成穩(wěn)定的O/W 型乳狀液所需降黏劑的總量，降低使用成本［13-14］。研究發(fā)現(xiàn)［15-16］，鼠李糖脂與其他表面活性劑復配后的界面活性明顯優(yōu)于未復配的表面活性劑。X-3 菌種產(chǎn)生脂肽分子量較小，具有較強的降低界面張力的能力，且價格便宜。考慮到鼠李糖脂和脂肽分子量和結(jié)構(gòu)間的差異，可獲得更好的界面分布，產(chǎn)生更好的界面活性，因此將兩種產(chǎn)表面活性劑菌產(chǎn)生的生物表面活性劑菌液復配使用。將T-1 菌種發(fā)酵液（含有鼠李糖脂）和X-3 菌種發(fā)酵液（含有脂肽）按不同體積比（1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1）復配，再與A18 原油混合，測得的黏度分別為 342、286、143、86、75、66、40 mPa·s。由于T-1菌產(chǎn)生大量鼠李糖脂，可較好的乳化原油，因此T-1菌含量越高，原油黏度越低。但X-3 菌產(chǎn)生的脂肽可有效降低油水界面張力，而油水界面張力的降低是影響驅(qū)油效率的重要因素。因此，考慮到T-1 菌和X-3 菌在體積比1∶1 的情況下與T-1 含量較高時的原油黏度相差較小，將T-1菌與X-3菌復配的體積比確定為1∶1。

2.3.3 降解菌和產(chǎn)表面活性劑菌復配比

表面活性劑對降解菌提高降解效率具有明顯的強化作用，因此將篩選得到的產(chǎn)表面活性劑菌（T-1 與X-3 菌復配體積比1∶1）和降解菌（QB26 和QB36 復配體積比1∶1）按不同體積比（1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1）復配后與原油混合，測得的黏度分別為 436、385、295、176、97、65、59 mPa·s。當產(chǎn)表面活性劑菌和降解菌的比值最大時，黏度達到最低值，表明增大產(chǎn)表面活性劑菌的加量，有助于原油體系的降黏。但同時要考慮降解作用對稠油整體降黏的影響，以及表面活性劑的發(fā)酵成本，因此T-1、X-3、QB26、QB36菌適宜的體積比為2∶2∶1∶1。

2.3.4 不同菌種復配體系的降黏性能

將30 mL QB26、QB36、T-1、X-3、QB26+QB36、T-1+X-3、T-1+X-3+QB26+QB36 與 30 g 原油混合，原油的黏度由混合前的1146 mPa·s 分別降至384、478、6、386、471、207、5 mPa·s。與混合前原油黏度相比，T-1 菌產(chǎn)生的鼠李糖脂降黏率可達99.5%，QB26 菌通過降解作用對原油的降黏率為66.5%，T-1+X-3+QB26+QB36體系降黏率也可達到99.6%，降黏率提高33.1%。盡管生物表面活性劑可大幅降低原油黏度，但原油乳化降黏過程是一種可逆過程，當在采出端原油飽和度高的情況下，可能因乳化反轉(zhuǎn)或破乳而發(fā)生增黏，從而影響開發(fā)效果，同時乳化原油對現(xiàn)場采出液的處理也會產(chǎn)生較大影響；與之相反，盡管降解作用的降黏幅度不如乳化過程，但降解作用改變原油組成物性，是一個不可逆過程，對提高采收率、提升原油品質(zhì)、降低采出液處理難度都有重要作用。

2.4 不同組合菌種降解后原油四組分分析

將QB26、QB36、T-1、X-3 四株菌液以體積比1∶1∶2∶2復配作用于稠油后的稠油四組分分析結(jié)果見表1。與空白相比，降解菌QB26、QB36 作用稠油后，各組分的相對含量均發(fā)生了變化，飽和烴相對含量均有不同程度的上升，芳香烴、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)相對含量降低。其中，QB26 菌使膠質(zhì)相對含量降低5.1%、瀝青質(zhì)相對含量降低2.7%，表明稠油經(jīng)微生物作用后，其化學組分發(fā)生了一定程度的變化。QB26、QB36兩種降解菌復配后，對稠油中膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的降解性能有一定提升，但并不明顯，說明兩種降解菌在底物選擇上具有一定重疊性，尚未發(fā)揮不同菌種對多種底物選擇的優(yōu)勢。將降解菌與產(chǎn)表面活性劑菌復配后，對膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的降解性能有進一步的提升。未加入產(chǎn)表面活性劑菌前，微生物降解作用主要針對膠質(zhì)瀝青質(zhì)中相對輕質(zhì)的組分，降解微生物自身也會產(chǎn)生一定量表面活性劑乳化原油，但含量有限；而產(chǎn)表面活性劑菌的加入增加了油水體系內(nèi)表面活性劑含量，從而進一步提升了降解微生物的活性，降低了膠質(zhì)瀝青質(zhì)中相對重質(zhì)組分的含量，盡管含量變化不大，但從之前降黏率數(shù)據(jù)分析，重質(zhì)組分的降解對原油降黏的意義重大。降解菌與產(chǎn)表面活性劑菌復配后，膠質(zhì)降解率分別比 QB26、QB36、QB26+QB36 提高 7.8% 、9.4%、6.9%，平均提高8.0%，瀝青質(zhì)降解率分別提高4.6%、5.5%、4.6%，平均提高4.9%，說明產(chǎn)表面活性劑菌的加入對降解大分子物質(zhì)、改善原油品質(zhì)作用明顯。

表1 不同菌種組合降解原油后四組分相對含量變化

2.5 不同組合菌種降解原油后變性梯度凝膠電泳分析

變性梯度凝膠電泳（DGGE）是檢測DNA 突變的一種電泳技術(shù)，是一種通過分離微生物基因組DNA 來研究環(huán)境樣品中微生物群落的多樣性及物種豐度的一種分子指紋技術(shù)［17-19］。在兩種降解菌、兩種產(chǎn)表面活性劑菌及四種菌復配后作用原油的溶液體系中提取菌群DNA，并進行DGGE 分析，結(jié)果見圖1。PCR 條帶亮度表明體系中微生物的濃度，泳道6中QB26、QB36的亮度明顯高于泳道5，結(jié)合之前黏度測定和四組分分析結(jié)果，表明產(chǎn)表面活性劑菌通過產(chǎn)生表面活性劑，使原油降黏增溶形成小液滴，易于被稠油降解菌捕獲降解。一方面降低了稠油黏度，改善了稠油品質(zhì)，另一方面提升了稠油降解菌數(shù)量。在泳道6中，QB26條帶亮度高于QB36，說明QB26在巖心中可利用稠油作為碳源進行擴增，因其利用稠油和營養(yǎng)的能力更強，在菌群分布中處于統(tǒng)治地位；QB36同樣作為稠油降解菌，因其在地層中利用稠油和注入營養(yǎng)液的能力比QB26低，因此造成其擴增速度低于QB26，數(shù)量少于QB26。

圖1 降解菌和產(chǎn)表面活性劑菌復配作用于原油后的變性梯度凝膠電泳照片

3 結(jié)論

在稠油微生物降解過程中，產(chǎn)表面活性劑菌的加入可明顯提高稠油降解菌的降解活性，在降低稠油黏度的同時改善稠油物性。產(chǎn)表面活性劑菌與稠油降解菌的復配體系對稠油的作用大于單獨使用稠油降解菌或者產(chǎn)表面活性菌。產(chǎn)表面活性劑菌與稠油降解菌的復配組合對稠油降黏的影響較大，產(chǎn)表面活性劑菌T-1、X-3與降解菌QB26、QB36適宜的體積比為2∶2∶1∶1。