Box-Behnken效應面法優化牛大力總黃酮提取工藝

譚志燦 丘思蘭2,3* 高 妮

1.廣州市醫藥職業學校，廣東 廣州 510430；2.廣州醫科大學附屬第五醫院，廣東 廣州 510700；3.廣州醫科大學第五臨床學院，廣東 廣州 510700

牛大力，別名大力牛、甜牛大力、大力薯、扒山虎、血藤、金鐘根、倒吊金錘等，原植物為攀緣灌木，為豆科植物美麗崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的干燥根[1]。全年均可采挖，以夏、秋季為佳，整理洗凈，除去蘆頭和須根，切厚片或切段，曬干即可。主產于廣東、廣西、海南、福建、湖南、云南、貴州等地,生于灌木林叢、路邊或疏林中。牛大力味甘、性平，歸肺、脾、腎經，能補虛潤肺、強筋活絡，用于病后虛弱、陰虛咳嗽等癥。現代研究表明，牛大力主要含有生物堿類化合物、黃酮類化合物、三萜類化合物、多糖類化合物和植物甾醇等多種成分[2-4]，具有鎮咳、祛痰、平喘、保肝、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、提高免疫功能等作用[5-8]。本實驗的研究對象為具有抗氧化活性的總黃酮[7]，采用Box-Behnken效應面法優選牛大力總黃酮提取工藝，為牛大力的綜合利用提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SP-756PC型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器)；CJ-100ST功率可調加溫定時型超聲波清洗機(深圳市超潔科技)；AL104型電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器)。

1.2 材料 牛大力(批號1803001，廣州市嶺南中藥飲片有限公司)經鑒定為豆科植物美麗崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的干燥根；蘆丁對照品(批號100086-201755，中國食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結果

2.1 含量測定[9-10]

2.1.1 對照品溶液 取蘆丁對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含蘆丁0.468 mg的對照品溶液。

2.1.2 標準曲線 精密量取“2.1.1”項下對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加乙醇至6 mL，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL，每次加入后均搖勻并放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻后放置15 min，以隨行試劑為空白，于505 nm處測定吸光度，得方程A=15.1364C-0.0163，r=0.9993，線性范圍0.009 36～0.056 16 mg/mL，式中A為吸光度、C為濃度。

2.1.3 供試品溶液 取牛大力藥材粉末約1 g，精密稱定，按照“2.2”項下的實驗方法制備供試品溶液。

2.1.4 樣品測定 精密量取“2.1.3”項下供試品溶液5 mL，照“2.1.2”項下的方法，測定吸光度，計算總黃酮含量。

2.2 Box-Behnken效應面法實驗設計[11]根據前期的單因素試驗結果，采用超聲提取法，功率500 W，溫度60 ℃，提取2次，選取乙醇濃度A、乙醇體積B、提取時間C為考察因素，以牛大力總黃酮的提取率為響應值，Box-Behnken效應面法的實驗設計及結果見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計及結果

采用Design Expert 7.0.0軟件對表1實驗數據進行多元線性回歸擬合，得二次多項回歸模型方程：Y=-16.052 19+0.198 12A+0.554 58B+0.197 63C+1.500 00×10-3AB-1.500 00×10-4AC+8.333 33×10-5BC-1.387 50×10-3A2-0.015 139B2-1.612 50×10-3C2。結果顯示，相關系數R2為0.987 6，變異系數C.V.為1.29%，模型擬合良好。由表2可知，3個考察因素A、B、C的一次項和二次項均達極顯著水平(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)。為了直觀反映分析結果，采用Design Expert軟件作出相應的等高線圖和效應面圖，如圖1、2所示。

表2 方程的顯著性檢驗及方差分析

注：*P<0.05顯著性差異；**P<0.01極顯著性差異。

2.3 驗證試驗 根據“2.2”項下的回歸方程確定最優工藝：乙醇濃度81.07%，乙醇體積21.63倍，超聲提取2次、每次52.51 min，溫度60 ℃。在此條件下，牛大力總黃酮理論提取率為3.821 1 mg/g。對最佳提取工藝進行3次驗證試驗，結果總黃酮平均提取率3.81 mg/g (RSD=0.961%)。驗證試驗表明，所優選的提取工藝穩定可行、重復性良好。

3 討論

實驗采用Box-Behnken效應面法進行實驗設計，優選牛大力總黃酮的提取工藝。Box-Behnken效應面法具有實驗次數少，結果預測精度高的特點，很好地解決了多變量問題。在實驗設計中，Center Points per Block設定為5，即中心點選擇5次重復，用以估計實驗誤差。

根據前期的單因素試驗結果，本次實驗選擇超聲提取法，固定超聲功率為500 W、超聲溫度為60 ℃、提取次數為2次，選取對實驗結果影響較大的3個因素(乙醇濃度、乙醇體積和提取時間)進行考察，以減少Box-Behnken效應面法的試驗次數。由結果可知，每個因素的交互作用較小，其1次項和2次項對牛大力總黃酮提取率貢獻較大。回歸模型通過顯著性檢驗及方差分析，具有統計學意義(P<0.01)，回歸模型可信度好。利用回歸模型算出最佳工藝參數，通過驗證試驗，相對標準偏差RSD值為0.961%，理論值和實驗值之間高度吻合，為牛大力的綜合利用提供實驗依據。